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高效液相色谱仪HPLC对维生素E的分离实验原理
作者:  浏览量:803  发布时间:2019-03-01 09:37:00

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【目的】探讨自动顶空气相色谱法测定血液中的乙醇。方法:取一定量的血液样品,加入叔丁醇作为内标,用顶空自动进样气相色谱火焰离子化检测器进行检测,以保留时间定性,内标法、峰面积比进行定量分析。结果:乙醇浓度在0.10mg/ml-3.00mg/ml范围内有好的线性(r=0.9999),检出限为0.01mg/ml,样品的加标回收率为97.8%-104.3%,RSD<2.0%。结论:所建立的方法简便、快速、准确,可用于血液中乙醇含量的检验。


乙醇为无色、易燃、易挥发的液体,俗称酒精,具有特殊芳香味,是各种酒类饮料中的主要成分。乙醇的急性毒害主要表现为对中枢神经系统的抑制作用,乙醇中毒多发生于饮酒。饮酒后驾驶机动车辆,易发生交通意外事故。血液中乙醇含量的检测可用于乙醇中毒和过量乙醇导致疾病的确认,对车辆驾驶人员血液中乙醇含量检测的结果可作为判定饮酒后或者醉酒后驾车的依据。

血液中乙醇的测定有化学法、酶法和气相色谱法等1,其中气相色谱法(包括直接进样气相色谱法和顶空气相色谱法)是目前较普遍使用的方法卜5],本研究利用乙醇的易挥发性,以叔丁醇为内标,选用DB-ALC1和DB-ALC2血液中酒精分析专用色谱柱,用顶空自动进样气相色谱火焰离子化检测器进行检测,建立的方法样品用量少,操作简便,准确度高,能对血液中的乙醇进行可靠分析。

一、材料与方法
1.仪器与试剂
气相色谱仪附氢火焰离子化检测器,顶空自动进样器(配1ml定量进样环),精密移液器。乙醛(1000pg/ml,Ac-cuStandard公司)。甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、叔丁醇均为色谱纯。

2.仪器条件
色谱柱:DB-ALC1毛细管色谱柱(30mx0.32mmx1.8pm)、DB-ALC2毛细管色谱柱(30mx0.32mmX1.2pm),色谱条件:柱温:恒温40°C,载气(N)流速3.0ml/min,进样口温度:150C,分流比5:1,检测器温度:250,氢气流速:35ml/min,空气流速:350ml/min,尾吹气(N2)流速:32ml/min。
顶空自动进样分析条件:加热箱温度65°c,样品瓶加热平衡时间10.0min,样品瓶22ml,不振摇,样品瓶加压时间0.10min,加压平衡时间0.05min,定量环充满时间0.10min,定量环平衡时间0.05min,定量环温度105C,传输线温度110C,进样时间1.00min。

3.标准曲线的制备
用精密移液器分别取0.10ml配制成不同浓度的乙醇标准溶液(0.10mg/ml、0.20mg/ml、0.50mg/ml、 1.00mg/ml、2.00mg/ml、3.00mg/ml)加入预先加有0.50ml叔丁醇内标工作液(浓度为0.04mg/ml)的顶空自动进样器样品瓶内,用封盖器盖上带有硅橡胶垫的顶空钳口盖,混匀,置于顶空自动进样器中加热后测定。以乙醇浓度为横坐标,乙醇对叔丁醇的峰面积比为纵坐标,绘制标准曲线。

4.样品测定
用精密移液器分别取0.10ml的空白、0.10ml的样品血加入预先加有0.50ml叔丁醇内标工作液(浓度为0.04mg/ml)的顶空自动进样器样品瓶内,用封盖器盖上带有硅橡胶垫的顶空钳口盖,混匀,置于顶空自动进样器中加热后测定。以保留时间定性,峰面积比定量。

二、结果与讨论
1.采用本法测定血液中的乙醇,样品用量少,操作简便,杂质干扰少,基线稳定,所需分析时间短(采用DB-ALC1毛细管柱时,乙醇的保留时间为2.16min,内标物叔丁醇的保留时间为3.12min;采用DB-ALC2毛细管柱时,乙醇的保留时间为2.20min,内标物叔丁醇的保留时间为2.96min),自动化程度高,能满足日常检测要求。在血液中乙醇的曰常检测中,通常采用单一色谱柱就可满足测定要求,必要时采用DB-ALC1和DB-ALC2双柱定性,能提高定性分析结果的准确度。

2.线性范围及检出限
乙醇浓度在0.10mg/ml~3.00mg/ml范围内有好的线性,采用DB-ALC2毛细管柱的测定结果见表1,回归方程为Y=-0.030+1.16X(r=0.9999),其中Y为乙醇对叔丁醇的峰面积比,X为乙醇浓度(mg/ml),方法检出限为0.01mg/ml。
表1标准测定结果

3.方法的精密度和准确度
空白血中分别加入不同量的乙醇后制成不同浓度的三份样品,采用DB-ALC2毛细管柱,每份样品重复测定6次,平均回收率在97.8%~104.3%之间,相对标准偏差RSD在2.0%以下,结果见表2。

表2回收率与精密度试验结果(n=6)

4.本法可同时分析甲醇、乙醛、乙醇、正丙醇、异丙醇等挥发性物质,这些物质在DB-ALC1和DB-ALC2毛细管柱上均能得到很好的分离,且峰形良好,它们在这两根柱子上的出峰情况不同,在DB-ALC1毛细管柱上的出峰顺序依次为:甲醇、乙醛、乙醇、异丙醇、叔丁醇(内标)、正丙醇;在DB-ALC2毛细管柱上的出峰顺序依次为:乙醛、甲醇、乙醇、异丙醇、叔丁醇(内标)、正丙醇,相关图谱见图1、图2。

图2采用DB-ALC2柱得到的色谱图内标物叔丁醇的作用不仅使定量准确,同时可用于实时监测,空白对照分析中无乙醇的色谱峰而有内标物的色谱峰为正常;分析样品时,内标物色谱峰正常而无乙醇的色谱峰时,可认为检验结果为阴性;如果样品中未出现内标物的色谱峰,结果无效,应查找原因,重新检验。

三、结论
本研究建立的自动顶空气相色谱法测定血液中的乙醇,方法简便,准确度高,能满足血液中乙醇含量的检验要求,方法自动化程度高,所需分析时间短,非常适合批量样品检验需求。

【参考文献】
[1]李世杰,郑雯,冯其光.血液中乙醇浓度检测方法Cr].预防医学情报杂志,2007,23(1):124-126.
[2]代娟,陈曼,赖翼,等.直接进样毛细管气相色谱法测定血液中乙醇含量的研究.中国卫生检验杂志,2010,20(2):283-284.
[3]李周儒,于常州,蔡红星.顶空气相色谱法测定血液中乙醇含量的探索.徐州医学院学报,2008,28(11):710-712.
[4]GA/T105-1995.血、尿中乙醇、甲醇、正丙醇、乙醛、丙酮、异丙醇、正丁醇、异戊醇的定性分析及乙醇、甲醇、正丙醇的定量分析方法
[5]GA/T842-2009.血液酒精含量的检验方法

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