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有哪些常用的高效液相色谱法?
作者:  浏览量:470  发布时间:2017-08-17 11:32:44

有哪些常用的高效液相色谱法

高效液相色谱法HighPerformanceLiquidChromatographyHPLC)又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支,以液体为流动相,采用高压输液系统,将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱,在柱内各成分被分离后,进入检测器进行检测,从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术应用。那么都有有哪些常用的高效液相色谱法?一起来看看小编的总结吧,如下:


一、液固吸附色谱法LSC

流动相为液体,固定相为固体吸附剂。

1、分离机制:利用溶质分子占据固定相表面吸附活性中心能力差异;

分离前提:K不等或k不等;

2、固定相:与LC比,固定相粒径不同<10μm);

3、流动相:底剂烷烃)+有机极性调节剂。

4.影响K的因素:

与固定相性质和流动相性质有关;

溶质分子极性↑,洗脱能力↓,k↑,tR↑;

溶剂系统极性↑,洗脱能力↑,k↓,tR↓;

注:调节溶剂极性,可以控制组分的保留时间;

5、出柱顺序:强极性组分后出柱,弱极性组分先出柱;

6、硅胶吸水量↑,LSC→LLC

硅胶含水量较小,吸附色谱,硅胶极性较大;

硅胶含水量>17%,分配色谱,硅胶失活→载体;

吸附的水→固定液


二、化学键合相色谱法BPC

1、化学键合相

1)分离机制:分配+吸附以LLC为基础);

2)特点:不易流失;热稳定性好;化学性能好;载样量大;适于梯度洗脱;


2、反相键合相色谱

1)分离机制:疏溶剂理论;

正相-流动相与溶质排斥力强,作用时间↑,K↑,组分tR↑;

反相-流动相与溶质排斥力弱,作用时间↓,K↓,组分tR↓;

2)固定相:极性小的烷基键合相;

C8柱,C18柱ODS柱-HPLC约80%问题);

3)流动相:

极性大的甲醇-水或乙腈-水;

流动相极性>固定相极性;

底剂+有机调节剂极性调节剂);

例:水+甲醇,乙腈,THF;

4)流动相极性与k的关系:流动相极性↑,洗脱能力↓,k↑,组分tR↑

5)出柱顺序:极性大的组分先出柱;极性小的组分后出柱;

6)适用:非极性~中等极性组分HPLC80%问题)


3、正相键合相色谱

1)分离机制:溶质分子与固定相之间定向作用力、诱导力、或氢键作用力

2)固定相:极性大的氰基或氨基键合相;

3)流动相:极性小同LSC);底剂+有机极性调节剂

4)流动相极性与K的关系:流动相极性↑,洗脱能力↑,组分tR↓,k↓;

5)出柱顺序:结构相近组分,极性小的组分先出柱,极性大的组分后出柱;

6)适用:氰基键合相与硅胶的柱选择性相似极性稍小),分离物质也相似;氨基键合相与硅胶性质差别大,碱性,分析极性大物质、糖类等;


4、离子对色谱和离子抑制色谱

反相离子对色谱法IPC或PIC)

反相色谱中,在极性流动相中加入离子对试剂,使被测组分与其中的反离子形成中性离子对,增加K和tR,以改善分离;

1)离子对试剂:烷基磺酸钠→分析碱,四丁基季胺盐→分析酸

2)影响K的因素:

a.与m的极性有关同反相色谱);

b.与R的链长有关:R↑长,极性↓小,tR↑,k↑;

3)适用:

较强的有机酸、碱;反相离子抑制色谱;

在反相色谱中,通过加入缓冲溶液调节流动相pH值,抑制;

组分解离,增加其K和tR,以达到改善分离目的;

1)离子抑制剂:弱酸、弱碱性物质;pH一定的缓冲溶液;

2)K的影响因素:与流动相极性有关,还与pH值有关;

选择流动相:应同时考虑极性及pH值;

酸性物质-加入酸HAc,tR↑,K↑;

碱性物质-加入碱NH3·H2O,tR↑,K↑;

调节pH范围:3.0~8.0;pH>8.0破坏键合相与载体的结合;pH<3.0腐蚀柱子;

3)适用:

极弱酸碱物质;pH=3~7弱酸;pH=7~8弱碱;两性化合物。


三、液-液分配色谱法LLC

1、分离机制:利用组分在两相中溶解度的差异

2、固定相:载体+固定液物理或机械涂渍法)

缺点:

系统内部压力大,易流失,不实用

固定液-极性→NLLC

固定液-非极性→RLLC

3、①正相色谱-固定液极性>流动相极性NLLC)

极性小的组分先出柱,极性大的组分后出柱:适于分离极性组分;

②反相色谱-固定液极性<流动相极性RLLC)

极性大的组分先出柱,极性小的组分后出柱:适于分离非极性组分;


四、高效液相色谱(HighPe-rformanceLiauidChromatography,HPLC)的主要优点

1、分辩率高于其它色谱法

2、速度快,十几分钟到几十分钟可完成;

3、重复性高;

4、高效相色谱柱可反复使用;

5、自动化操作,分析精确度高。根据分离过程中溶质分子与固定相相互作用的差别,高效液相色谱可分为四个基本类型,即液-固色谱、液-液色谱、离子交换色谱和体积排阻色谱。


五、高效液相色谱在生物领域中广泛用于下列产物的分离和鉴定

氨基酸及其衍生物;有机酸;甾体化合物;生物硷;抗菌素;糖类;卟啉;核酸及其降解产物;蛋白质、酶和多肽;脂类等。


六、高效液相色谱的常见问题有:

1、涡流扩散(Eddydiffusion)

流动相碰到较大的固体颗粒,就像流水碰到石头一样产生涡流。如果柱装填得不均匀,有的部分松散或有细沟,则流动相的速度就快;有的部位结块或装直紧密则流就慢,多条流路有快有慢,就使区带变宽。因此,固相载体的颗粒要小而均匀,装柱要松紧均一,这样涡流扩散小,柱效率高。

2、分子扩散(Moleculardiffusion)

分子扩散就是物质分子由浓度高的区域向浓度低的区域运动,也称纵向分子扩散。要减少分子扩散就要采用小而均匀的固相颗粒装柱。同时在操作时,如果流速太慢,被分离物质停留时间长,则扩散严重。

3、质量转移(Masstransfer)

被分离物质要在流动相与固定相中平衡,这样才能形成较窄的区带。在液相色谱中,溶质分子要在两个液相之间进行分配,或在固相上被吸附和解吸附均需要一定的时间。当流速快时,转移速度慢,来不及达到平衡动相就向前移,这各物质的非平衡移动,使区带变宽。

4、动相流速

当流速太低时,分子扩散严重,特别是在气相色谱中尤为突出。如将理论塔板高度对流速作图,理论塔板高度随流速增加而急速下降,当达到最低值时,流速再加大则质量转移起主要作用,理论塔板高度又加大。在高效液相色谱中,流速稍快影响不大,但在凝胶过滤色谱中,因为物质要渗透到凝胶内部,所以质量转移影响大,流速咖大会降低柱效率。

5、固定相颗粒大小

定相颗粒越小柱效率越高,对流动相流动的阻力越大,需要加大压力才能使它流动。


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