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高效液相色谱法原理
作者:  浏览量:315  发布时间:2018-01-02 02:13:46

一、高效液相色谱法原理概述

HPLC是在经典的液相色谱法基础上发展起来的,其以液体作为流动相,并采用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术。其分离机制与常规柱色谱相同,但填料更加精细,需高压泵推动,柱效高,分析速度快。与气相色谱不同的是液相色谱中流动相亦参与组分的分离过程,其组成、比例和pH值可灵活调节,分离模式多样。在实际操作中主要通过改变流动相的组成来调节样品在色谱柱的保留值和选择性,从而使不同样品得到分离。


高效液相色谱法自20世纪60年代问世以来,由于使用了高压输液泵、全多孔微粒填充柱和高灵敏度检测器,实现了对样品的高速、高效和高灵敏度的分离测定。高效液相色谱由于吸取了经典液相色谱的研制经验,并引入微处理机技术,极大的提高了仪器的自动化水平和分析精度。现在用微处理机控制的高效液相色谱仪,其自动化程度很高,既能控制仪器的操作参数(如溶剂梯度洗脱、流动相流量、柱温、自动进样、洗脱液收集、检测器功能等),又能对获得的色谱图进行收缩、放大、叠加,以及对保留数据和峰高、峰面积进行处理等,为色谱分析工作者提供了高效率、功能齐全的分析工具。


高效液相色谱法的应用范围十分广泛,对样品的适用性广,不受分析对象挥发性和热稳定性的限制,几乎所有的化合物包括高沸点、极性、离子型化合物和大分子物质均可用高效液相色谱法分析测定,因而弥补了气相色谱法的不足。在目前已知的有机化合物中,可用气相色谱分析的约占20% ,而80% 则需用高效液相色谱来分析。HPLC因其具有分离效能高、分析速度快、检测灵敏度好、能分析和分离高沸点且不能气化的热不稳定生理活性物质的特点而被广泛应用于生物化学、药物及临床分析,世界各国己将该法收载于药典。


二、高效液相色谱法原理图

原理图1

原理图2

原理图3



三、高效液相色谱法原理的应用

于HPLC分析不受温度和样品沸点限制,因此具有更广阔的应用潜力。经过30多年的迅速发展,高效液相色谱法在基础理论、仪器装置和色谱柱等方面的研究已趋于成熟,现已成为化学化工、环境、药学、食品等多个领域中最具优势的分离分析方法之一。

基本原理

液相色谱根据分离机理的不同可分为:

液固吸附色谱

液液分配色谱

离子交换色谱

离子对色谱法

分子排阻色谱

或凝胶渗透色谱

A.液-固吸附色谱

流动相为液体,固定相为固体吸附剂,根据物质吸附作用的不同来分离物质。

B.液-液分配色谱

流动相和固定相都是液体的色谱法即为液-液色谱,是利用样品组分在两种不相溶的液相间的分配来进行分离。一种液相为流动相,另一种是涂于载体上的固定相。

流动相极性小于固定相极性的液-液色谱法称为正相分配色谱法。

流动相极性大于固定相极性的液-液色谱法称为反相分配色谱法。

C.离子交换色谱

D.离子对色谱法

E.分子排阻色谱法


四、实验步骤

1. 系统开机准备

1)接通电源。

2)打开电源,预热相关的检测器,其中紫外检测器(2487)需要预热30分钟以上;荧光检测器(2474)需要预热1小时以上;示差折光检测器(2414)需要预热至少24小时。

3)打开高效液相色谱仪主机的电源。

4)启动微机。

2. 操作步骤

1)运行Millunnium32软件,登陆用户。

2)Millunnium32软件窗口进行检测方法和测量参数设定,如梯度法或者自行设定检测方法、流动相的组分及比例、测定波长、洗脱时间等。

3)输入样品名称、注释及操作者姓名。

4)将空白样品分别放入参比池和样品池,校准用户基线。

5)将样品放入样品池,开始测量。

6)打开数据处理页面,进行数据处理。

7)保存数据。

8)检测下一个样品。

3. 系统关机清理

1)关闭高效液相色谱仪主机及各检测器的电源。平常待机时,示差折光检测器(2414)无须关机,只要降低泵流速至0.1mL/min,使其继续保持平衡稳定即可。

2)退出Millunnium32软件。

3)关闭计算机。

4)抽下电源插座,切断电源。

5)作好仪器使用记录。

6)清理实验室,打扫卫生。


五、实验注意事项

1. 严禁未经培训人员上机操作。

2. 无关人员不得进入仪器操作室。

3. 不得在仪器操作室内做与光谱检测无关的事情。

4. 认真阅读使用说明,精心操作。

5. 详细记载实验的检测项目及数据文件名。

6. 打扫实验室卫生,关好水电门窗,离开实验室。


六、高效液相色谱仪的应用领域

1、在环保方面,HPLC可以应用在:

1)农药残留量分析:含氯农药 、有机磷  农药 、除虫菊等;

2)致癌物质:硝基呋喃及其代谢物、霉素、亚硝胺、苯并芘等;

3)水质分析:内分泌污染物等;

4)其它……


2、在生化方面,HPLC可以应用于:

1)蛋白质分析;

2)肽类的分析;

3)核酸;

4)氨基酸 ;

5)其它……


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