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液相色谱仪组成及其工作原理
作者:  浏览量:1060  发布时间:2019-02-28 02:11:29

液相色谱仪组成及其工作原理

液相色谱仪系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。储液器中的流动相被高压泵打入系统,样品溶液经进样器进入流动相,被流动相载入色谱柱(固定相)内,由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数,在两相中作相对运动时,经过反复多次的吸附-解吸的分配过程,各组分在移动速度上产生较大的差别,被分离成单个组分依次从柱内流出,通过检测器时,样品浓度被转换成电信号传送到记录仪,数据以图谱形式打印出来高效液相色谱仪主要有进样系统、输液系统、分离系统、检测系统和数据处理系统,下面将分别叙述液相色谱仪组成及其工作原理。


一、液相色谱仪组成及其工作原理

1、分离系统

液相色谱仪组成部分分离系统包括色谱柱、连接管和恒温器等。色谱柱一般长度为10~50cm(需要两根连用时,可在二者之间加一连接管),内径为2~5mm,由优质不锈钢或厚壁玻璃管或钛合金等材料制成,组内装有直径为5~10μm粒度的固定相(由基质和固定液构成)。固定相中的基质是由机械强度高的树脂或硅胶构成,它们都有惰性(如硅胶表面的硅酸基因基本已除去)、多孔性(孔径可达1000Φ)和比表面积大的特点,加之其表面经过机械涂渍(与气相色谱中固定相的制备一样),或者用化学法偶联各种基因(如磷酸基、季胺基、羟甲基、苯基、氨基或各种长度碳链的烷基等)或配体的有机化合物。因此,这类固定相对结构不同的物质有良好的选择性。例如,在多孔性硅胶表面偶联豌豆凝集素(PSA)后,就可以把成纤维细胞中的一种糖蛋白分离出来。另外,固定相基质粒小,柱床极易达到均匀、致密状态,极易降低涡流扩散效应。基质粒度小,微孔浅,样品在微孔区内传质短。这些对缩小谱带宽度、提高分辨率是有益的。根据柱效理论分析,基质粒度小,塔板理论数N就越大。这也进一步证明基质粒度小,会提高分辨率的道理。再者,高效液相色谱的恒温器可使温度从室温调到60C,通过改善传质速度,缩短分析时间,就可增加层析柱的效率。


2、进样系统 

液相色谱仪组成部分进样系统一般采用隔膜注射进样器或高压进样间完成进样操作,进样量是恒定的。这对提高分析样品的重复性是有益的。


3、输液系统

液相色谱仪组成部分输液系统包括高压泵、流动相贮存器和梯度仪三部分。高压泵的一般压强为l.47~4.4X10Pa,流速可调且稳定,当高压流动相通过层析柱时,可降低样品在柱中的扩散效应,可加快其在柱中的移动速度,这对提高分辨率、回收样品、保持样品的生物活性等都是有利的。流动相贮存器和梯度仪,可使流动相随固定相和样品的性质而改变,包括改变洗脱液的极性、离子强度、PH值,或改用竞争性抑制剂或变性剂等。这就可使各种物质(即使仅有一个基团的差别或是同分异构体)都能获得有效分离。


二、高效液相色谱仪操作步骤

知晓了以上液相色谱仪组成及其工作原理,那么理解高效液相色谱仪操作步骤也就不难了,高效液相色谱仪操作步骤如下: 

1、过滤流动相,根据需要选择不同的滤膜。

2、对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。


3、打开HPLC工作站(包括计算机软件和色谱仪),连接好流动相管道,连接检测系统。

4、进入HPLC控制界面主菜单,点击manual,进入手动菜单。

5、有一段时间没用,或者换了新的流动相,需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵,直接在泵的出水口,用针头抽取。冲洗进样阀,需要在manual菜单下,先点击purge,再点击start,冲洗时速度不要超过10 ml/min。

6、调节流量,初次使用新的流动相,可以先试一下压力,流速越大,压力越大,一般不要超过2000。点击injure,选用合适的流速,点击on,走基线,观察基线的情况。

7、设计走样方法。点击file,选取select users and methods,可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法,点击new method。选取需要的配件,包括进样阀,泵,检测器等,根据需要而不同。选完后,点击protocol。一个完整的走样方法需要包括:a.进样前的稳流,一般2-5分钟;b.基线归零;c.进样阀的loading-inject转换;d.走样时间,随不同的样品而不同。

8、进样和进样后操作。选定走样方法,点击start。进样,所有的样品均需过滤。方法走完后,点击postrun,可记录数据和做标记等。全部样品走完后,再用上面的方法走一段基线,洗掉剩余物。

9、关机时,先关计算机,再关液相色谱。

10、填写登记本,由负责人签字。


三、高效液相色谱仪操作注意事项:

1、高效液相色谱仪设置注意事项

1)、流动相均需色谱纯度,水用20M的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。

2)、柱子是非常脆弱的,第一次做的方法,先不要让液体过柱子。

3)、所有过柱子的液体均需严格的过滤。

4)、压力不能太大,zui好不要超过2000 psi


2、高效液相色谱仪操作注意事项

1)、使用保护住

使用”保护柱”,能够延长色谱柱的使用寿命。简单的说,”保护柱”即是很短的色谱柱,填装和所使用液相色谱柱相同的填料。正确使用装在液相色谱柱前面的”保护柱”,可以阻拦一些容易损坏液相色谱柱的物质。而达到延长柱子寿命的效果。如果使用”保护柱”不当。会造成反效果。因为在保护柱使用过程中。如污染达到一定程度而没有及时更换,累积的杂物很可能会冲入色谱柱中,反而会造成色谱柱损坏。因此。使用”保护柱”时,zui重要的是要知道什幺时候该换保护柱。该换的时候就必须要立即更换。


2)选择高品质的柱子

选择高品质的柱子,并注意使用方法;可以延长柱子的使用寿命。一般认为同一厂牌、同一型号的柱子之间的品质都相同,对品质管理很严格的厂家而言,这说法是成立的。但如果厂家品质管理不够严格,即使是同一批号的新柱子之间的品质也有差异。所以,选用柱子时必须选择管理严格的高品质柱子,我们知道,任何柱子使用过后都会产生变化。尤其如在强酸或强碱条件下使用,柱子更易产生变化。因此,应尽量选用pH适用范围大的柱子。在开发新分析方法时,许多专家建议不要使用旧柱子。因柱子一经使用。柱性会改变;如此一来,使用旧柱子开发出来的新分析方法,很可能在再使用同厂牌的新柱子分析时。发生无法达到预定效果的情况。总的说。开发新分析方法时要使用品质好的新柱子;并且一支柱子最好使用在一种分析方法上;则柱子寿命可以延长。


3)定期冲洗柱子

定期冲洗柱子可以延长柱子使用寿命。我们知道柱子使用一段时间后总会有一些杂质累积在柱内。这些杂质不会随着流动相出来,自然会逐渐影响柱子的品质。这些杂质在后来的分析谱图上出现。而造成出现怪峰、基线不平等现象。简单的解决方法是用较强的流动相冲洗。zui好是在每次分析某一产品完成后冲洗。如果分析时使用缓冲剂时﹐zui好用水来取代缓冲剂。先使用有机和水的混合溶液为流动相冲洗缓冲剂。接着再用100%有机溶剂冲洗。如果不先用有机和水的混合溶液冲洗,而直接用100%有机溶剂冲洗的话,缓冲剂很可能会沉淀出来,而损坏柱子的品质。使用10-20倍柱体积的量来冲洗基本就足够了。专家建议zui好将100%有机溶剂冲洗的条件加在分析实验程序完毕地zui后,如此一来每天在开机前都会用100%机溶剂冲洗。一般硅胶柱可以反冲洗处理﹐即是在将冲洗前将柱子倒反接后再冲洗。打算使用反冲洗处理前,zui好先参考柱子的保养说明书。所以要真正保护柱子,使柱子的寿命延长,zui好是使用”保护柱”和定期冲洗柱子。


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