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高效液相色谱仪HPLC对维生素E的分离实验原理
作者:  浏览量:339  发布时间:2017-08-21 09:59:57

高效液相色谱仪HPLC对维生素E的分离实验原理

一、高效液相色谱理论发展简况

色谱法的分离原理是:溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时,由于与固定相(stationary phase)发生作用(吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和)的大小、强弱不同,在固定相中滞留时间不同,从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。


色谱法最早是由俄国植物学家茨维特(Tswett)在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的,色谱法(Chromatography)因之得名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。


液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相,称为经典液相色谱法,此方法柱效低、时间长(常有几个小时)。高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography,HPLC)是在经典液相色谱法的基础上,于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀,小颗粒具有高柱效,但会引起高阻力,需用高压输送流动相,故又称高压液相色谱法(High Pressure  Liquid  Chromatography,HPLC)。又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography,HSLP)。也称现代液相色谱。


二、高效液相色谱仪HPLC的实验优点

高压——压力可达150~300 Kg/cm2。色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。

高速——流速为0.1~10.0 ml/min。

高效——可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。

高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。


HPLC与经典液相色谱相比有以下优点:

速度快——通常分析一个样品在15~30 min,有些样品甚至在5 min内即可完成。

分辨率高——可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。

灵敏度高——紫外检测器可达0.01ng,荧光和电化学检测器可达0.1pg。

柱子可反复使用——用一根色谱柱可分离不同的化合物。

样品量少,容易回收——样品经过色谱柱后不被破坏,可以收集单一组分或做制备。


三、高效液相色谱仪HPLC对维生素E的分离实验原理

维生素E又称生育酚,目前已经确认的有8种异构体,αβγδ生育酚和αβγδ生育三烯酚,天然存在的α-生育酚的维生素E活性最强。α-生育酚醋酸酯是α-生育酚的酯化产品,常用在维生素胶囊中,具有很强的氧化稳定性。样品以乙醇溶解,采用RPC法,以乙醇为流动相,C18色谱柱分离,紫外检测器284 nm 波长检测,外标法定量,测定维生素E胶囊中α-生育酚醋酸酯的含量。


维生素E的分离既可以用反相液相色谱法,也可以用正相液相色谱法。本实验液相色谱仪采用正相液相色谱法用的是极性填料分离柱如硅胶柱,流动相是弱极性或非极性溶剂如正己烷 ,试样样品因吸附作用在固定相中保留。在非极性溶剂中适当添加少量极性溶剂可以获得任意所需极性的流动相。色谱分析条件主要包括流动相组成与流速、色谱柱、检测波长、色谱柱温度等。通过实验主要为了解流动相中添加极性溶剂对试样样品的分离和保留的影响,基本目标是将α-VE 与其它成分分离。


色谱仪检测维生素E主要有β,α,δ和γ四 种异构体,其中又以α异构体的生理作用为最明显。其中合成品为消旋体(dl-α),天然品为右旋体(d-α)等一般药用为合成品。药典中记载的维生素E包含dl-生育酚及其醋酸酯与琥珀酸钙盐,dl-α生育酚及其醋酸酯与琥珀酸酯。也就是说通常所说的维生素E 是一个混合物,除了游离的的生育酚羧酸酯可能同时存在外也可能共存多种结构异构体,甚至还可能有其它共存有机物。


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