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液相色谱-串联质谱法在兽药残留确证和筛选中的应用
作者:  浏览量:486  发布时间:2017-12-07 01:21:28

液相色谱-串联质谱法在兽药残留确证和筛选中的应用

一、概述

兽药残留已逐渐成为人们普遍关注的一个社会热点问题。近年来兽药残留引起食物中毒和影响畜禽产品出口的报道越来越多。药物残留不仅可以直接对人体产生急慢性毒性作用,引起细菌耐药性的增加,还可以通过环境和食物链的作用间接对人体健康造成潜在危害。2017年6月,农业部出台了《全国遏制动物源细菌耐药行动计划(2017-2020年)》,进一步加强兽用抗菌药物管理。


目前,我国共制定了7537项农兽药残留标准,基本覆盖常用农兽药品种和主要食品农产品种类。下一步,将按照农业部已经制定的农兽药残留标准制修订5年行动计划,每年新制定兽药残留限量标准100项。到2025年,兽药残留限量标准达到2200项,与国际标准相衔接,基本实现生产有标可依、产品有标可检、执法有标可判。


二、液相色谱-串联质谱法在兽药残留确证和筛选中的应用

23日提请十二届全国人大常委会第二十五次会议审议的国务院关于研究处理食品安全法执法检查报告及审议意见情况的反馈报告提出,有关部门正在加快农兽药残留标准的制修订,目前农兽药残留标准已基本覆盖我国大宗农产品和常规农兽药品种。


国家食品药品监督管理总局局长、国务院食品安全办主任毕井泉受国务院委托向全国人大常委会作报告时表示,农业部与国家卫生计生委组建农药残留、兽药残留两个标准审评委员会,目前已制定5724项农兽药残留限量和932项检测方法国家标准。


毕井泉说,计划每年新制定农药残留限量标准1000项,兽药残留限量标准100项,5年内农兽药残留限量标准总数达到10000项以上,将与国际食品法典基本一致。


根据食品安全法规定,国家对农药的使用实行严格的管理制度,加快淘汰剧毒、高毒、高残留农药,推动替代产品的研发和应用,鼓励使用高效低毒低残留农药。


根据报告,国务院食品安全办会同发展改革委、财政部等部门研究起草了《“十三五”国家食品安全规划》。计划到2020年,农作物病虫害绿色防控覆盖率达30%以上,农药利用率达40%以上,主要农产品质量安全监测总体合格率达到97%以上。


在种植养殖环节源头治理方面,报告指出,农业部按照成熟一个淘汰一个的原则,分期分批对高毒农药采取禁限用措施。禁用高毒农药39种,高毒农药使用量占农药使用总量的比例下降到2%以下,淘汰小、乱、差饲料企业近4000家。


1、内酰胺类

内酰胺类(卢lactams)是广泛应用于治疗动物细菌感染的抗生素,具有抑制细菌细胞合成和抗革兰氏阳性菌的作用,包括青霉素类和头孢菌素类两大类。代表性的化合物有:苄青霉素、氨苄青霉素、阿莫西林和头孢唑啉等。研究HPLC—MS在.8一内酰胺残留分析中的应用最早见于1989年口]。早期的青霉素类药物残留分析使用热喷雾接口技术,电喷雾接口技术出现以后,取代了前者成为近年来人们研究的重点。1998年,Heller等。使用电喷雾离子阱技术测定了牛奶中7种|8一内酰胺类抗生素残留。样品经乙腈提取和沉淀蛋白,用c柱净化浓缩后,进行LC—ESI—MS/MS分析。采用正离子模式监测[M+HI,多级离子阱能够提供较多碎片离子的结构信息,并获得了较高的灵敏度,其检出限达到5t~g/L(苄青霉素)和10t~g/L(氨苄青霉素、羟苄青霉素、邻氯青霉素、头孢匹林、头孢噻呋、头孢唑啉)。Riediker等采用LC—ESI—Ms/Ms测定了牛奶中的阿莫西林、氨苄西林、邻氯青霉素、苯唑青霉素和青霉素G,用d一青霉素G作为内标物。样品先经高速离心、正己烷脱脂后,过c。柱(kt柱时保持pH值大于6)。每个药物选择监测2或3个离子以提高检测灵敏度,检出限为0.4~1_1g/L。随后,他们把这个方法应用于生奶的检测c53。Bruno等_6建立了测定牛奶中1O种允许在奶牛中使用的一内酰胺抗生素残留检测方法,青霉素V为内标。在5>g/L的添加浓度下,测得回收率在7O~108之问,相对标准偏差(RSD)在5~11之间。Ito等采用串联三重四极杆质谱仪测定了牛肝、肾和肌肉中的青霉素,采用负离子扫描模式进行监测,如[M—HI、[M—H—CO。]一、[M—H一144]等,他们确定最佳的液相色谱洗脱液pH值为7.7,方法对6种青霉素的检测定量限为50g/kg。Becker等研究了牛肌肉、肾、奶中15种青霉素类和头孢菌素类的LC—MS/MS测定方法。他们把15种药物分成两类,分别采用ESI(4-)和ES1(一)的模式进行监测,分析两类成分均得到最大灵敏度。Baere等_c采用LC—ESI—MS/MS测定了烤鸡组织(肾、肝脏、肌肉、脂肪)中的羟氨苄青霉素。样品经0.1mol/L的磷酸二氢钾提取后,经c。柱净化,以氨苄西林为内标物进行分析检测。结果在25t~g/kg、50t~g/kg、100t~g/kg的添加量下,其回收率的RSD均在1O%以内。Mufioz等口介绍了内酰胺、皮质类固醇、一兴奋剂、氯霉素类等药物进行LC—MS/MS法测定的仪器条件,他们认为液质联用技术是解决兽药残留分析的有效方法。


2、磺胺类

磺胺类(Sulfonamides,SAs)是具有对氨基苯磺酰胺结构的化学合成抗菌素,能够抑制细菌叶酸代谢,因此在兽医临床上用于预防和治疗细菌感染性疾病,其中代表性的药物有:磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺问甲氧嘧啶等。欧盟和美国等国家规定SAs在牛奶和肌肉中的最高残留限量(MRL,以SAs总量计)为100~g/kg,与我国的现行规定一致。Porteru采用LC-ESI—MS/MS测定了肾组织中的4种SAs。样品用酸化乙酸乙酯提取后,依次过氨基柱和阳离子交换柱(SCX)净化。监测离子包括[M4-H]和其相应的3个子离子,当样品离子比例与标准品一致时,其定量限为800~g/kg。VanEeckhout等口采用LC—MS/MS在线提取和净化方法,建立了肾脏中8种SAs的筛选和确证测定方法,实现在线进一步提取和净化。该方法在1O~200g/kg的添加范围内,表现出良好的线性关系,批内和批问RSD均小于16,回收率在78-82之问,检出限在5~13.5t~g/kg之问。Ito列分别采用HPLC—uV法和LC—ESI—MS/MS法测定了牛、猪和鸡肝脏和肾中的1O种SAs,前者是常规的定量方法,后者作为定性确证方法。Volmer等u采用LC—ESI—MS/MS法测定了牛奶中的21种SAs,回收率在72~96之问,定量限在0.2~5t~g/L。vanRhijn等采用三级串联四极杆质谱仪,研究了d一磺胺二甲基嘧啶为内标和直接外标法定量的区别,结果表明在0.5、1.0、1.5MRL的添加浓度下,二者的差别很小。HellerE¨测定了鸡蛋中的SAs,样品经过cs柱净化处理后,先进行HPLC—uV筛选,阳性样品用离子阱LC—MS/MS进行定性。Verzegnassi等采用LC—ESI—MS/MS对蜂蜜中的1O种SAs进行了测定。样品中的SAs先经水解与蜂蜜基质离解分开,再经液液分配和过滤后,进行分析,监测每个药物的2个特征子离子,在50Mg/kg的添加水平下,其回收率在44-73之问。该法研究了基质离子抑制对定量结果的影响,结果表明在进行痕量分析时,离子抑制效应普遍存在。Casetta等l1。采用LC—ESI—MS/MS测定了蜂蜜中SAs,测定磺胺二甲基嘧啶和磺胺噻唑的检出限可以达到10~g/kg。Thompson等口。采用LC—MS/MS测定了蜂蜜中的7种SAs,检出限在0.5~2ug/kg。我国学者也研究了LC-MS/MS测定SAs的残留检测方法。庞国芳等Ezo]研究了家禽组织中的16种SAs残留量的测定方法。样品提取净化后,进行LC~ESI—MS/MS分析,检出限为1.O~12.0~g/kg,定量限为2.o~24.0~g/kg。Shao等[2采用LC—ESI—MS/MS测定了猪肌肉、肝脏、肾脏中17种SAs。样品经液液分配和固相萃取(SPE)净化后进行分析,在三个不同添加浓度下,17种SAs的回收率在52~120之间,方法检出限为0.01~1.0ug/kg。


3、喹诺酮类

喹诺酮类(Quinolones,QNs)是近20年来迅速发展起来的一类十分重要的抗菌素,能抑制细菌DNA螺旋酶,干扰DNA合成,具有抗菌谱广、高效、低毒等特点,广泛的应用于畜牧和水产养殖业。代表性的QNs药物有氟喹酸、恩诺沙星、环丙沙星和沙拉沙星等。Schneider等胡采用LC-ESI—MS/MS测定了牛和鸡肝脏组织种的单诺沙星。样品经50甲醇(含0.15mol/L磷酸)提取后将提取液调节至pH8.5,二氯甲烷萃取后,浓缩至于,用流动相溶解后测定。通过选择监测[M+H](m/z358)母离子碰撞(CID)产生的碎片离子进行定性、定量分析。加入三氯乙酸,能使检测的强度增加4倍,样品在50#g/kg添加浓度测定值变异系数为19.8。Doerge等[2。]采用LC—APCI—MS和LC—MS/MS测定了鲶鱼组织中的奥啉酸、萘啶酸、吡哌酸和氟喹酸。在该条件下,QNs均存在[M+H—H。O]。。中性丢失碎片,采用恒定中性丢失(CNL)MS-MS扫描模式,可用于QNs的多残留检测和筛选。LC—MS/MS的检出限在0.08~0.16~g/kg之问,比LC—APCI—MS低10倍。Schilling等报道了鲶鱼中沙拉沙星的L&ESDMS/MS确证方法。用1mol/LNaOH提取样品,加入乙腈和磷酸沉淀蛋白质并中和样品液的pH值,提取液经C。柱净化,流动相洗脱后测定。采用MRM模式监测[M+HI的3个子离子[M+H—H。O]、[M+H—CO。一CHN=CH。]、[M+H—CO],根据3个子离子丰度比。进行确认分析,每个监测离子的相对丰度比与当天测定标准品相对丰度比差异不超过±10,该方法是测定QNs的经典方法。Volmer等报道了奶、鱼肉和人尿样中15种QNs的L&ESI—MS/MS的多残留检测分析方法。文中讨论了QNs的结构、理化参数和流动相pH等条件对色谱分离和ESI等条件的影响,以QNs的裂解途径和各种MS-MS分析模式下在QNs残留分析和代谢中的应用。方法中部分药物的母离子选用[M+H—HO]而不是[M+HI进入碰撞室CID,因此实现了类似于MS-MS/MS的检测,其检测的灵敏度和选择性明显高于MS—MS。vanVynchtll2]采用L&ESI—MS/MS测定了猪肾脏中的11种QNs残留。样品经过C。和阳离子交换柱净化,MRM模式测定,其回收率在83~98之问。精密度试验以奎宁为内标,回收率在89~109之间,相对标准偏差在15以内,检出限在MRL/4以下。2002年,Toussaint等利用建立的上述检测方法,测定了11种QNs在猪肾脏中的残留量,验证了该方法的有效性,结果表明检出限≤50ug/kg,并考察了方法的精密度和准确度,其中7种两性QNs的回收率稳定,而4种酸性QNs的回收率稳定性较差。2005年,Toussaintl_2。]对处理方法进行了进一步优化,4种酸性QNs的平均回收率的重复性和重现性分别为5.1和12.5,而原来为分别为33.2和37.3。利用同一方法心,通过欧洲8家实验室问比对试验,进一步验证了¨种QNs在猪肾脏中残留测定方法的有效性,比对结果表明,方法在实验室内和实验室问的重复性和精密度均较为满意,完全能满足欧盟对QNs进行定量、定性测定的需要。VanHoof。。。。介绍了牛组织、奶和水产品中的8种QNs确认方法。文中对分析方法和确认参数进行了讨论,以满足欧盟2002/657/EEC决议的要求。


4、四环素类

四环素类(Tetracyclines,TCs)为广谱抗生素,对革兰氏阴性和阳性细菌、立克次氏体等具有作用,其作用机理主要是和30S核糖体亚基的末端结合,从而干扰细菌蛋白质的合成。代表性的TCs药物有四环素、金霉素和土霉素等。近几年,液质联用技术被成功的应用于四环素类药物残留的测定。Oka等研究了LC—ESI—MS/MS测定四环素、土霉素、金霉素和脱氧土霉素的残留分析方法。该方法通过正离子MRM模式,以[M+H]为母离子,监测[M+H—NH。~H。O]和[M+H—NH。]。。两个子离子,而脱氧土霉素只监测[M+H~NH。]子离子,但只给出少量的结构确认数据,在此条件下很难确证样品中四环素类抗生素。Vartanian等[3采用离子阱(MS。)进行监测时也发现了类似的结果,当脱氧土霉素开始脱NH。的时候,其它TCs已经开始脱HO了,他们认为是其它三种化合物C位置上存在一0H的缘故。Kamel等3_研究了流动相组分和被测物浓度在ESI正、负离子模式分析5种TCs中的影响。当流动相中含有1乙酸时,[M+HI的灵敏度最大,而当流动相中氢氧化铵的浓度为0.05mol/L时,[M—H]一的灵敏度最大,但总体上,正离子模式的灵敏度远大于负离子模式。为提高定量的准确性,很多方法采用去甲基金霉素为内标进行测定。Nakazawa等_3报道了LC~AP—CI—MS/MS测定TCs残留量的方法。该方法以去甲基金霉素为内标,对测定猪和牛肌肉、肾脏、肝脏、鸡肝脏和肌肉、奶、蛋以及蜂蜜中的TCs进行了研究。他们认为APCI源的源温是关键参数,必须保证流动相中草酸分解为水和二氧化碳,以防止堵塞。VanEeckhout等_3同样采用去甲基金霉素为内标,用Oa—sisHLB萃取柱在线萃取和净化牛肾脏中的四环素、土霉素、金霉素和脱氧土霉素。该方法在1OO~1200肚g/kg的添加范围内,表现出良好的线性关系,批内和批间RSD均小于7,回收率在71~91%之间,检出限在18~24g/kg之间。由于该方法大大缩短了样品处理过程和分析时间,因此更适合于日常分析。Cherlet等口。研究了猪可食性组织中TCs的多残留测定方法。用提取液提取TCs、差向TCs和内标物去甲基金霉素,用三氯乙酸除去蛋白并过滤,经HLB柱净化后进行L~MS/MS分析。作者研究了肌肉、脂肪和肾脏的中在MRL以及MRL/2和2MRL添加量时的检测结果有效性,其RSD在允许的范围内,方法检出限在0.5~4.5ng/g之间。Zurhelle等研究了在鸡体内饲喂TCs后,药物在鸡体内的存在形式及测定方法。样品经过简单的匀浆和稀释处理后,在线进行净化和浓缩后进行LC—MS/MS测定。结果表明OTC、TC、CTC在鸡体内不仅以原形存在,而且以4一位异构体、异CTC等形式存在。


三、总结

以上液相色谱-串联质谱法在兽药残留确证和筛选中的应用,希望对大家有参考作用,势必液相色谱仪会在兽药残留领域方面技术更成熟,更灵敏、更高选择性。


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