全国统一咨询订购热线:139-5165-7500

联系科捷

HOTLINE
全国统一免费服务热线

139-5165-7500

地址:南京市浦口区万寿路15号南工大产业园E1五楼

电话:139-5165-7500

传真:025-83738955

E-mail:2021782209@qq.com

微信售后服务二维码

扫描科捷二维码
液相色谱仪配套知识当前位置:首页  ›› 离子色谱仪系列百科 ›› 液相色谱仪配套知识
增强高效液相色谱柱效的方法
作者:  浏览量:740  发布时间:2019-03-01 10:05:33

随着科技发展进步,在高效液相色谱法中,围绕如何提高色谱柱效率这个中心问题,填充色谱柱的固定相已发生了急剧的变化,由无定形填料到球形填料,由薄壳型填料到全多孔填料,由大颗粒到小颗粒,由全多孔粒子到灌流色谱的流通粒子,由全多孔球形微粒到非多孔的更小微粒。上述柱填料的变化使色谱工作者利用降低柱填料粒径的方法,已使色谱柱的柱效相对稳定在10000~25000块/m(理论塔板数)之间。在使用小粒径的填料会导致色谱柱高压力降低,使用现代高效液相色谱仪设备,其输液泵的操作压力基本已限定在35~40MPa,因此当欲用1~3μm的柱填料时,只能使用3~5cm的短色谱柱,这样通过调节柱长,而使所希望的柱效和柱压力降之间的矛盾得到妥善的解决,但此时只能使用较低的流速来实现快速分析。在高效液相色谱仪分析中,如何选择高效液相色谱柱?以及增强高效液相色谱柱效的方法探索是我们一直想知道的问题,如下小编发表一些看法供大家参考交流。


一、如何选择高效液相色谱柱?

小编认为只要注意了解高效液相色谱柱才会懂得如何选择,因此这里介绍下色谱柱硅胶基质填料:


1、正相色谱

正相色谱用的固定相通常为硅胶(Silica),以及其他具有极性官能团,如胺基团(ZH2,APS)和氰基团(CN,CPS)的键合相填料。由于硅胶表面的硅羟基(SiOH)或其他团的极性教强,因此,分离的次序是依据样品中的各组份的极性大小,即极性强落的组份zui先被冲洗出色谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低,如:正乙烷(Hexane),氯(Chloroform)二氯甲烷(Methylence Chloride)等.


2、反相色谱

反相色谱填料常是以硅胶为基础,表面键合有极性相对教弱的官能团的键合相。反相色谱所使用的流动相极性教强,通常为水,缓冲液与甲醇,已腈等混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性教强组合zui先被冲出,而极性弱的组份会在色谱柱上有更强的保留。常用的反相填料有C18(ODS) C8(MOS)。C4(B)C6H5(Phenyl)等。


3、聚合物填料:

聚合物调料多为聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸至等,其主要优点是在PG值为1-14均可使用。相对与硅胶基质的C18填料,这类填料具有更强的淑水性;大孔的聚合物填料对蛋白质等样品的分离非常有效。现在的聚合物填料的缺点是相对硅胶基质填料,色谱柱柱效教低。


4、其他无机填料

其它HPLC的无机填料色谱柱也已经商品化。由于其特殊的性质,一般仅限于特殊的用途。如墨化碳也用于正逐渐成为反相色谱填料。这种填料的分离不同与硅胶基质烷基键合相,石墨化碳的表面即是保留的基础,不再需其它的表面改性,该柱填料一般比烷基键合硅胶或多孔聚合物填料的保留能力更强,石墨化碳可用于分离某些几何导构体,又由于HPLC流动相中不会被溶解,这类柱可在任何PH与温度下使用。氧化铝也可用于HPLC,氧化铝微粒刚性强,可制成稳定的色谱柱柱床,其优点是可在PH高达12的流动相中使用。但由于氧化铝与碱性化合物作用也很强,应用范围受到一定的限制,所以未能广泛应用,新型氧化诰填料也可用于HPLC,商品化的仅有聚合物涂层的多孔氧化诰微球色谱柱,应用PH范围1~14,温度可达到1000C。由于氧化诰填料几年才开始研究,加之前的实验难度,其重要用途与优势尚在进行中。


5、怎样选择填料粒度

目前,商品化的色谱料粒度从1um到超过30um均有销售,而目前分析分离主要用3,5和10um填料,填料的粒度主要影响填充柱的两个参数,即柱效和背压。粒度越小,填充柱的柱效越高;小于3um的填料应用,在相同选择性条件下,提高柱效可提高分离度,但不是唯一的因素。如果固定相选择是真确,但是分离度不够,那么选择更小粒度的填料是很用有的,3um填料填充柱的柱数比相同条件下的5UM填料的柱效提高近30%;然而;3um的色相谱的背压却是5um的2倍。与此同时,柱效提高意味着在相同条件下可以选择更短的色谱柱,以缩短分析时间,另外,可以采用低粘度的溶剂做流动相或增加色谱柱的使用温度,比如用乙腈代替甲醇,以降低色谱柱的压力。

增强高效液相色谱柱效的方法


二、增强高效液相色谱柱效的方法?

要增强高效液相色谱柱的效率可从以下几方面入手:

1、降低移动相的流速,但会使分析时间延长。

2、减少固定相的量,但色谱柱中样品的负载量也随之减小。

3、减小固定相的颗粒度,但不能过分,过分后色谱柱的渗透率也会减小。

4、选用低粘度的移动相,以利于快速传质,但却不利于多组份分析。

5、适当提高柱温,可降低移动相的粘度,但柱效和分离度也随之降低。

6、尽量减小停滞移动相的体积,但却加快了移动相的流速。


从以上介绍可看出,在色谱分析过程中,各种因素是互相联系和制约的。只有通过对柱效值的跟踪测算,对自己分析方法不断的研究和实践,才能找到zui佳的工作条件。


三、如何延长高效液相的色谱柱的使用寿命?

色谱柱的使用寿命主要是柱效和柱压两指标来衡量,如果一支色谱柱柱效太低或柱压太高,通常被认为该色谱柱已经结束。因此,延长色谱柱使用寿命的关键是,消除引起柱效下降和柱压升高的因素。以下是色谱柱的日常使用注意事项:

1、流动相的PH应在使用的范围内

以常规硅胶为基质的键合相填料通常的PH值适用范围是2.0-8.0,由于填料中存在Si-C和Si-O键,流动相超过其PH范围将会导致硅胶基质流失和键合相碳链断裂,使柱效下降,使用寿命变短,若超过此范围应选择能承受相应PH值的色谱柱。每次使用结束后立即用适合于色谱柱储存并与所使用的流动相互溶的溶剂清洗,并完全置换掉原来所使用的流动相。由于流动相的PH控制不当而对色谱柱造成的损害,通常很难使色谱柱恢复,因此必须认真对待,严格控制流动相的PH值。


2、正确使用缓冲盐

缓冲盐通常易溶于水,难溶于有机溶剂,因此缓冲盐使用不当会使其析出,堵塞填料基质上的微孔和颗粒间的空隙,使填料板结,柱压上升;同时阻碍了基质上键合的碳链自由舒展,使色谱柱的保留能力下降,柱效降低。在反相色谱中,如用高浓度的盐或缓冲液作洗脱剂,应先用10%左右的低浓度的有机相洗脱剂过渡一下,否则缓冲液中的盐在高浓度的有机相中很容易析出,堵塞色谱柱。缓冲盐析出后,去除非常困难,因此正确使用缓冲盐的方法可归结为一句话:使用前要过滤,使用后要冲洗。若缓冲盐析出可用甲醇/水=20/80以0.2mL/min流速反向冲洗色谱柱过夜。


3、去除样品和流动相中的固体颗粒

样品和流动相中含有的固体颗粒物质会堵塞色谱柱筛板,筛板被堵住不仅会引起柱压的升高,而且也会引起柱效下降,因为筛板的堵塞会引起液流不均,导致色谱峰型拖尾、变宽,从而使柱效下降。因此,建议使用超纯水和色谱纯试剂。样品也要尽可能清洁,zui好对样品采取合适的过滤或者高速离心的方法进行前期处理;流动相过0.45μm滤膜,采用0.22μm滤膜更好,但一定要注意选择合适的滤膜。


4、使用保护柱

样品和流动相经过滤后并不能完全消除固体颗粒物质,因为泵的磨损、密封圈和管路的老化也会产生固体颗粒物质,这些固体颗粒被流动相带入色谱柱,堵塞筛板,导致柱压升高、柱效下降。保护柱上有筛板,其孔径与色谱柱孔径相同,因此可以阻止固体颗粒物质到达色谱柱,有效防止色谱柱筛板的堵塞。由于柱压升高在分析故障中占很大比例,因此,除对样品和流动相进行过滤外,zui好在色谱柱进样端加上保护柱。


5、防止强保留物质在色谱柱上存留

强保留物质和大分子化合物在色谱柱中累积,对样品中的化合物产生额外的保留行为,不仅引起峰型变宽、拖尾,使柱效下降,同时也会引起保留时间的变化,累积到一定程度时还会导致柱压升高。由于强保留物质和大分子化合物对色谱分离的影响是一个累积效应,需要一定的时间才会体现出来,但对许多药品特别是复杂样品而言,很难判断其是否是含有强保留物质,因此要防止强保留物质的累积,需要在每天的日常维护中用纯甲醇或乙腈清洗色谱柱。


6、色谱柱的保存 

反相色谱柱每天实验后的保养,使用缓冲液或含盐的流动相,实验完成后应用10%的甲醇水溶液冲洗掉色谱柱中的盐,再过渡到高有机相,并保存在有机溶剂中。不能用纯水冲洗色谱柱,应该在水中加入10%的甲醇,防止将填料冲塌陷。如色谱柱要长时间保存,必须存于合适的溶剂下。对于反相柱可以储存于纯甲醇或乙腈中,正相柱可以储存于严格脱水后的纯正己烷中,并将购买新色谱柱时附送的堵头堵上,储存的温度zui好是室温。


7、色谱柱的彻底清洁和再生

因为高效液相色谱柱是消耗品,随着使用时间或进样次数的增加,当出现色谱峰高降低,峰宽加大或出现肩峰时,一般来说可能是柱效下降。需要定期进行彻底清洗和再生,不同的色谱柱清洗方法各不相同,反相柱分别用甲醇:水=90:10,纯甲醇,异丙醇,二氯甲烷等溶剂作为流动相,依次冲洗,每种流动相流经色谱柱不少于20倍的色谱柱体积,然后再以相反的次序冲洗。正相柱分别用正己烷,异丙醇,二氯甲烷,甲醇等溶剂做流动相,顺次冲洗,每种流动相流经色谱柱不少于20倍的柱体积(异丙醇粘度大,可降低流速,避免压力过高),注意使用溶剂的次序不要颠倒,用甲醇冲洗完后,再以相反的次序冲洗至正己烷,所有的流动相必须严格脱水。但是需要指出是,无论采用什么方法再生色谱柱,均不可能完全恢复柱效至新柱水平。


以上只是简单列举了常见的事项,在操作过程中一定要注意:色谱柱在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动;当柱子和色谱仪联结时,阀件或管路一定要清洗干净;要注意流动相的脱气;避免使用高粘度的溶剂作为流动相;进样样品要干净;每天分析工作结束后,要清洗进样阀中残留的样品;每天分析测定结束后,都要用适当的溶剂来清洗柱;若分析柱长期不使用,应用适当有机溶剂保存并封闭。


由于色谱柱的厂家、填充物、组成成分的不同,以及分离的试验物质的特异性,每个人都通过自己长期的工作经验摸索出了独特的方法使用及维护色谱柱,达到延长色谱柱使用寿命的目的。而我们只有做好色谱柱的日常维护工作,才能更好的完成任务,才能真正体现HPLC的高效性。



浏览过此页面的朋友还阅读过:

等度高效液相色谱仪LC600B

梯度高效液相色谱仪LC600B

等度高效液相色谱仪LC600A

梯度高效液相色谱仪LC600A

等度高效液相色谱仪LC600B

梯度高效液相色谱仪LC600B

等度高效液相色谱仪LC600A

梯度高效液相色谱仪LC600A

IC-600离子色谱仪

水质检测专用离子色谱仪IC-700

气相色谱仪

更多仪器选择……

         IC-600离子色谱仪

        水质检测专用离子色谱仪IC-700

气相色谱仪

分析仪器


相关价格,欢迎来电咨询:手机——18751879877   QQ-2783814645

我们为给您提供专业详细的解决方案!



相关产品

在线QQ:2021782209  客服信箱:2021782209@qq.com 全国免费服务电话:139-5165-7500

版权所有copyright ©2016-2019 南京科捷分析仪器有限公司 http://http://www.kj17.com.cn/ 苏ICP备10007070号