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反相高效液相色谱的基本原理及其应用
作者:  浏览量:410  发布时间:2018-01-02 02:35:48


一、概述

高效液相色谱经过年的发展,在色谱理论研究、仪器研究水平、分析实践应用等方面已经取得长足的进步,本文“反相高效液相色谱的基本原理及其应用”,主要介绍了反相高效液相色谱的基本原理和特点,以及影响因素,并对其在生物化学、生物工程、环境监测中的应用以及在精细有机合成中的应用分别进行了举例。


二、反相高效液相色谱的定义

反相高效液相色谱是由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系,它正好与由极性固定相和弱极性流动相所组成的液相色谱体系(正相色谱)相反。RP-HPLC的典型的固定相是十八烷基键合硅胶,典型的流动相是甲醇和乙腈。RP-HPLC是当今液相色谱的最主要的分离模式,几乎可用于所有能溶于极性或弱极性溶剂中的有机物的分离。反相色谱法适于分离非极性、极性或离子型化合物,大部分的分析任务皆由反相色谱法完成。


三、反相高效液相色谱的基本原理

反相高效液相色谱是化学键合相色谱法的一种。化学键合相色谱法是由液液色谱法发展起来

的,是为了解决在分离过程中,机械吸附在载体上的固体液的流失问题而发展出来的一种新方法。


在反相键合相色谱法中使用的是非极性键合固定相。它是将全多孔(或薄壳)微粒硅胶载体,经酸活化处理后与含轻基链(c4、C8、C18)或苯基的硅烷化试剂反应,生成表面具有烷基或苯基的非极性固定相。如共价结合到载体上的直链碳氢化合物正辛基等。关于反相色谱的分离机理,吸附色谱的作用机制认为溶质在固定相上的保留主要是疏水作用,在高效液相色谱中又被称为疏溶剂作用。根据疏溶剂理论,当溶质分子进入极性流动相后,即占据流动相中相应的空间,而排挤一部分溶剂分子。当溶质分子被流动相推动与固定相接触时,溶质分子的非极性部分或非极性因子会将非极性固定相上附着的溶剂膜排挤开,而直接与非极性固定相上的烷基官能团相结合(吸附)形成缔合络合物,构成单分子吸附层。这种疏溶剂的吸附作用是可逆的,当流动相极性减少时,这种疏溶剂斥力下降,会发生解缔,并将溶质分子解放而被洗脱下来。


四、反相键合相色谱法的分离原理

在反相键合相色谱法中使用的是非极性键合固定相。它是将全多孔或薄壳微粒硅胶载体,经酸活化处理后与含轻基链或苯基的硅烷化试剂反应,生成表面具有烷基或苯基的非极性固定相。如共价结合到载体上的直链碳氢化合物正辛基等。关于反相色谱的分离机理,吸附色谱的作用机制认为溶质在固定相上的保留主要是疏水作用,在高效液相色谱中又被称为疏溶剂作用。根据疏溶剂理论,当溶质分子进入极性流动相后,即占据流动相中相应的空间,而排挤一部分溶剂分子。当溶质分子被流动相推动与固定相接触时,溶质分子的非极性部分或非极性因子会将非极性固定相上附着的溶剂膜排挤开,而直接与非极性固定相上的烷基官能团相结合吸附形成缔合络合物,构成单分子吸附层。这种疏溶剂的吸附作用是可逆的,当流动相极性减少时,这种疏溶剂斥力卜降,会发生解缔,并将溶质分子解放而被洗脱下来。


反相色谱中疏水性越强的化合物越容易从流动相中挤出去,在色谱柱中滞留时间也长,所以反

相色谱法中不同的化合物根据它们的疏水特性得到分离。反相色谱法适于分离带有不同疏水基团的化合物,亦即非极性基团的化合物。此外,反相色谱法可用于分离带有不同极性基团的化合物。可以通过改变流动相的溶剂及其组成和,以影响溶质分子与流动相的相互作用,改变它们的滞留行为。另外,反相色谱中水的流动相中占的比例伸缩性很大,可以从一,从而使反相色谱可用于水溶性、脂溶性化合物的分离。反相色谱法中的固定相是被共价结合到硅胶载体上的直链饱和烷烃,其链的长短不同,最长的是十八烷基,这也是使用得最多的固定相。直链饱和烷烃疏水特性随着碳氢链的长度而增加,在反相色谱柱中溶质由于疏溶的有机溶剂,以得到不同强度的流动相,这些有机溶剂称为修饰剂。反相色谱中最常用的有机溶剂有甲醇和乙睛,此外,乙醇、四氢吠喃、异丙醇及二氧六环也常被用作修饰剂。

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五、反相高效液相色谱的应用

在多肽分析的反相液相色谱条件下,流动相多采用酸性的、低离子强度的水溶液,并加入一定比例能与水互溶的乙腈、甲醇或异丙醇等有机改性试剂,洗脱方式分为正常洗脱方式(流动相组成保持恒 定)和梯度洗脱方式(流动相中有机组分的比例随时间不断增加)。


测定合成肽粗品的一般方法是采用十八烷基硅烷键合硅胶 (250×4.6mm,5μm,孔径300目)为色谱柱,流动相A相为0.1% 三氟乙酸-水,流动相B相为0.1%三氟乙酸-乙腈,梯度洗脱,流动相 B相在洗脱剂中含量按1%/min线性关系增长,流速为1.0ml/min,检测波长为210nm,色谱柱温度为室温。图1为合成肽粗品的HPLC色 谱图,由实验结果可知,在梯度洗脱条件下,混合肽中多数组分可以被洗脱下来,进而进行分离分析。


在反相高效液相色谱法分离多肽研究中,可以通过改变各色谱参数来调节样品中各个组分的分离情况,这些参数包括不同固定相的色谱柱、色谱柱的规格、pH调节剂、流动相的流速、有机溶剂组成、温度、梯度变化时间等。


六、总结

总的来说,反相高效液相色谱的主要优点还是蛮多的:1.几乎可用于所有能溶于极性或弱极性溶剂中的有机物的分离。 反相色谱法适于分离非极性,极性或离子型化合物,大部分的分析任务皆由反相色谱法完成;2.具有柱效高,使用寿命长,重现性好,几乎对各种类型的有机化合物都具有良好的选择性,用可用于梯度洗脱操作;3.反相色谱应用广泛,技术方面也比较成熟,可以与大多数检测器相匹配。南京科捷分析仪器有限公司将为您提供更多完整的相关资料。


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