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怎样选择合适的液相色谱柱?
作者:  浏览量:349  发布时间:2017-09-25 10:56:52

怎样选择合适的液相色谱柱?

一、选择合适的液相色谱柱必要性

来自于色谱系统的污染主要指,HPLC仪器系统中部件磨损而产生的固体颗粒,以及流动相系统过滤不完全残留的固体颗粒。来自于样品的污染主要指未完全溶解的样品或者已完全溶解的样品进入色谱系统中,由于样品溶剂和流动相溶剂对样品溶解存在的溶解度差异,导致沉淀析出污染系统。


特别是对于中药、天然产物、合成中间体及生物药品的检测,因基质的复杂性,色谱柱受污染的情况会更加严重。污染会导致色谱系统压力升高、色谱柱塌陷、填料变色等,从而带来检测成本高,测试结果不准确等各种影响。


1、以下几种情况建议使用液相保护柱:

1)中药、天然产物及合成中间体等基质较复杂的样品分析--因溶解性差异导致样品析出而污染分析柱的情况比较严重,梯度洗脱时影响更大。


2)生物样品分析--因样品的不可逆吸附导致的污染,保护柱可先于分析柱承受这种污染,从而延长分析柱寿命。


保护柱很重要,但选择合适的保护柱更重要,选择或使用不当也可能带来截然相反的效果。


2、液相保护柱分类及选择

1)从材质上分:

不锈钢材质和PEEK(聚醚醚酮)材质,PEEK材质优缺点--样品对金属离子比较敏感时,选择PEEK材质比较合适,比如某些蛋白分板会用到PEEK材质的分析柱,主要就是考虑到这方面的因素;不锈钢材质优缺点--大部分小分子化合物的分析,选择不锈钢材质保护柱居多,特别是当流动相体系使用到四氢呋喃THF)或DMSO等一些溶解性较强的溶剂时,必须选择不锈钢材质,甚至对于HPLC系统的管路也需要替换成不锈钢材质,因THF对于PEEK管路有相当强的腐蚀作用。


2)从结构上分:

卡套式柱芯+柱套)和直接填装短柱。直接填装短柱公优缺点--这种结构的保护柱实质就是短柱优缺点--这种的保护柱实质就是短的色谱柱,一般填装的填料跟分析柱填料完全一样,生物样品分析中,用这种类型保护柱居多,除可过滤一些不溶颗粒外,还可除去一些在分析柱上易吸附的杂质。缺点是,一次性使用,污染严重时,只能报废。


卡套式保护柱优缺点--卡套式保护柱的柱套可反复使用,柱芯污染后可替换,厂家会提倡配套瓣保护柱芯,但购买时需要注意,柱芯中有与分析柱匹配的填料,需要确认柱芯中的填料类型再购买。同时,柱芯与柱套需是来源一同一厂家的同一规格否则,会存在匹配上的差异,导致峰型异常或者漏液。


3)从连接方式上分:

独立式和直连式。独立式保护柱优缺点是保护柱和分析柱这间用一段管路连接,不用担心与分析柱在连接上的匹配问题。但使用管路连接时,连接不当容易产生死体积。 直连式保护柱优缺点--保护柱接口带螺纹,可直接与分析柱连接,死体积小,UPLC分析时建议选择直连式保护柱子缺点:购买时需保证接口与分析柱匹配。


二、怎样选择合适的液相色谱柱

1、根据分离规模确定色谱柱大致的规格

表1按分离规模分类的高效液相色谱柱

怎样选择合适的液相色谱柱?


2、从分析物的物理化学性质入手,找出大致的色谱柱类型 选柱前应详细掌握分析物的分子量或分子量范围)、溶解性、是否解离等信息,然后根 据这些性质找到合适的色谱柱类型。

表2液相色谱分离模式的选择

怎样选择合适的液相色谱柱?

3、几点特殊说明:

1)反相色谱柱可以对非极性、弱极性、中等极性以及部分强极性化合物进行分离,是应用 最广的色谱柱;反相色谱柱以“分配作用”保留分析物,主要以分析物在两相中的溶解性进行选择,有时不能对同分异构体和结构类似物进行分离;

2)部分解离性较弱的化合物,可通过向流动相加入酸、碱、盐的形式使分子以某种稳定并且保留性强的形式存在,然后用反相柱进行分析,这种分析方法包括“离子抑制色谱”和“离子对色谱”;

3)在反相分析中,C18柱是首选色谱柱,如果保留太强,可换成C8进行分析,以节约分析时间;

4)PLRP是以聚苯乙烯-二乙烯基苯为填料的色谱柱,为反相柱,疏水性与C18相近,但不具有次级相互作用,分析碱性化合物时不会发生拖尾。

5)包括Silica、氨基柱、氰基柱在内的正相色谱柱,分别通过硅羟基、胺基、氰基与分析物中的极性基团发生极性相互作用,从而实现对分析物的保留和分离,适用于极性化合物的分离,对许多同分异构体和结构类似物也能实现较好分离。


4、对填料的要求

1)填料类型

普通的硅胶键合相色谱柱在流动相pH处于2~7.5范围时表现稳定,超出这一范围就会发生键合相水解(pH<2)或硅胶溶解(pH>7.5)等现象,因而具体到那一款色谱柱的选择时,应保证填料所能耐受的pH范围符合分析条件的要求。色谱耗材制造公司通过改进键合技术, 已经制造出pH适用范围较宽的硅胶键合相色谱柱,比如Diamonsil(2)能够耐受1.5~9的pH值,可以满足绝大多数情况下的反相色谱分析。


PLRP为聚合物基质的反相填料,由于不存在上述水解和溶解的危险,因而能够在各种 pH值下使用,是目前pH值适用范围最宽的色谱柱,其主要缺点是柱效较低,重现性差和在有机相中的溶胀性质等。


2)填料粒径

目前分析中大多使用粒径为1.7~5μm的填料。根据速率理论,塔板高度与填料的粒径近似成正比,因而减小填料粒径可以得到更高的柱效,当分离效果不理想时可以考虑使用更细的填料;使用细粒径填料时,柱长可适当缩短,以提高分析速度;使用细粒径填料时,高的柱效有效抑制了色谱峰的展宽,能够获得较高的分析灵敏度;细粒径填料会显著增大柱压。


分析者可根据对柱效、分析时间和分析灵敏度的要求对填料粒径进行选择。


3)填料的孔径

填料的孔径对化合物的分子量具有限制。孔径为100Å左右的填料仅能用于相对分子量不超过2000的化合物的分离,更大的分子难以进入孔内,在填料上的保留较弱,需要使用孔径更大的填料,比如300Å。


5、色谱柱规格

1)内径

在理想情况下,当填料、柱长和流动相优化线速度确定时,色谱柱内径的变化将只影响上样量和灵敏度,柱效、分离度、分析时间等均不发生变化。与内径为4.6mm的色谱柱相 比,内径为2.1mm的色谱柱的截面积仅相当于前者的1/5,所以为取得相同的线速度,后 者所需的体积流速仅为前者的1/5,因而使用细径柱能显著减少溶剂用量;同样由于截面积小,样品组分在细径柱中的稀释也较小,可以得到较高的灵敏度;细径柱的最大载样量也相应减小。


归纳起来,细径柱的优势就在于节约溶剂,灵敏度高,与质谱检测器的兼容性更好适用于低样品量的分析。但细径柱要求仪器系统优化到最好。


2)长度

单组份或组分较少时,用短柱即可达到较好的分离;组份较多时,则应选择长柱。当然以上只是对于最常使用的5μm填料的色谱柱而言,如果选择了细填料的柱子,柱长可以短一些,比如,150mm、3μm色谱柱的柱效相当于250mm、5μm的色谱柱。


注:选择细内径柱或和较短色谱柱时,由于色谱柱的死体积较小,柱外效应的影响会增大,造成柱效下降。这种情况下,应选择短而细的连接管,如果有条件还可更换体积较小的进样阀和流通池。


6、其他特殊要求

色谱柱选择实例分析

1)生育酚分析

图片8

生育酚共有α、β、γ、δ四种,分子结构包括苯并杂环、一个较长的碳链,其差别仅在苯环上甲基的数量和位置,其中α-生育酚具有三个甲基,β-、γ-生育酚具有两个甲基、互为同分异构体,而δ-生育酚有一个甲基。极性较弱,属脂溶性物质,同时又能溶于甲醇/水,分子量小于500,所以选色谱柱时也许有两种选择:正相柱和反相柱。填料孔径则可锁定在100Å左右。


在实际分析中,反相C18柱仅能分出三个峰如图一):δ峰、γ和β共同出的峰、α峰。γ和β生育酚的差别仅在于苯环上甲基的位置不同,以“分配作用”为作用模式的C18 对它们选择性基本没有差异,而所用的流动相为95%以上的甲醇水溶液(甲醇含量太低时,保留时间太长),这种溶剂体系对这两种生育酚的溶解性也基本没有差异,所以γ-和β-生育酚在反相模式下无法分离。

图片9

正相的Silica柱和氨基柱则对化合物上的基团具有选择性,像γ-和β-生育酚结构上这样细小的差别就能被分辨,从而达到分离。

图片10

在实际分析中,C18柱常常用于常规生育酚总量测定,因为总量测定时并不需要分开γ和β生育酚;而正相柱则常用于生育酚组成的测定。


2)有机酸分析

有机酸是一类典型的可解离型有机化合物,通常具有较高的水溶性,它们的相对分子量处于几十~几百之间,因而色谱柱可以锁定在离子抑制色谱、离子对色谱或离子交换色谱,其中前两种用的均是反相色谱柱。


分析这类物质时,离子抑制色谱法是最常用的方法。由于羧基的存在,有机酸的极性较强,为了使这类物质能被反相柱保留,流动相中会有较大比例的水,有时甚至用到100%水溶液;然而在水介质中有机酸会部分解离,每一种纯净物都会以两种甚至两种以上的形式存在,这是造成有机酸峰形变差的根本原因。


解决办法就是将流动相的pH值设定为酸性,以抑制羧基的解离,这样化合物以单一的未解离形式存在,疏水性增强,在反相柱上的保留也增大。pH值可参考解离性最强的有机酸的pKa,通常流动相pH值比该化合物的pKa小一个数量级,就能使每种化合物得到比较完美的峰形。


3)胺基化合物

离子对色谱(反相色谱柱)或离子交换色谱柱。


4)蛋白质和肽

首先得到化合物的分子量范围的信息,按表2的分子量选择范围选择填料的孔径,如果不详细或范围比较模糊,则选择孔径为300Å的填料。


三、液相色谱柱的正确使用、维护及保养方法与技巧

1、正确使用和故障判断

当我们发现分离不好时,大多数人的第一反应是色谱柱出问题了,有没有排查柱子以外的情况是否正常呢?其实,好多情况下,输液泵、检测器以及保护柱等等都很容易被我们忽视,举两个例子:

例1)我们实验室的HPLC仪器使用频率很高,昨天做实验还没有出现异常,但是今天换了一根新柱子,和往常一样操作,冲了半天,发现基线始终无法平衡,而且远远超出噪声的范围,流动相,泵的原因都检查过了,并不存在问题,这柱子不会是旧的吧?经最后仔细检查,发现导致的原因是流通池漏液了。


例2)我刚拿到一根新的色谱柱,一开始做实验就出现对照品分叉的现象,稍微加大一点流速还可以看到柱子连接处有漏液,新柱子就出现这样的情况,该不会是柱子塌陷了吧?其实呢,如果光从谱图反映的情况来看,就好像是柱子塌陷的情况,但是有经验的人看过前边的描述后,应该可以判断出来了,这个问题导致的原因来自连接。这种情况也是常常会被我们所忽略的,下面是详细的说明:

各厂家HPLC色谱柱的形状各不相同,如果连接错误或者忽略了此问题,就有可能产生死体积,造成峰形异常或者漏液的现象。首先要注意的就是连接管路的长短是否够,管路是否已经插到柱头底部,即我们所说的管前端长度,差别见下表,这个问题可以通过使用PEEK管路和接头来解决,另外就是配管切口是否平整。

图片11

2、维护和保养

在实验过程中经常遇到的情况:

·新的色谱柱,直接上分析条件来分析样品,发现分离情况不稳定。

·新的色谱柱,使用中发现压力突然升高。

·新的色谱柱,发现分离度、保留时间发生了变化。

·色谱柱使用不频繁,一开始分析样品效果比较好,但是,在使用过程中发现柱效下降快、峰形异常的情况。

·色谱峰形异常,基线不稳。

…………

当发生以上情况,请仔细检查,是否有某个操作疏忽了?


1)测试柱性能

通常情况下,我们建议用户在拿到色谱柱后,第一件事情就是在一台性能完好的仪器系统上,按照厂家说明书对色谱柱进行柱效测试。其实,对于一个合格的色谱分析工作者来说,拿到一根新色谱柱,要开始一个课题之前,都会这样做,目的有二:一、了解色谱柱之前的情况并判断色谱柱是否正常。二、将检测结果小心保存,当实验过程中发现异常时,在检测柱效进行对比,来进一步排查原因。


2)当反相使用高浓度缓冲盐时,注意过渡在使用高浓度的盐或缓冲液作洗脱剂时,一定要注意应先用10%左右的低浓度的有机相洗脱剂过渡一下,否则缓冲液中的盐在高浓度的有机相中很容易析出,造成系统堵塞。另外,在发现系统压力升高异常时,要仔细检查,段段排除包括保护柱、混合器、管路或者流通池等。


3)当更换色谱柱时,原来的实验情况发生变化

首先,如果之前开发方法时色谱柱已经做过别的样品,那么之前的样品或使用的流动相对这个样品分析可能有干扰,只能重新找条件。建议:开发方法时使用新的色谱柱。其次,如果是更换了品牌发生这样的情况,可能是由于不同品牌的键合技术不同,造成了选择性的细微差异,需要调整条件,并再次确定出峰顺序有些样品的洗脱顺序会改变)。再次,如果是更换了同品牌型号的新的色谱柱发生这种情况,请检查之前分离时目标与杂质的分离度是否符合要求Rs大于1.5),如果一开始只是勉强分开Rs小于1.5),那只能说明方法没有优化好,需要再次进行优化。


4)样品及前处理

样品要尽可能清洁,可选用样品过滤器或样品预处理柱SPE)对样品进行预处理;若样品不便处理,要使用保护柱。流动相中所使用的各种有机溶剂要使用色谱纯,配流动相的水最好是超纯水或双蒸水。如果将所配得流动相再经过0.45μm的滤膜过滤一次则更好,尤其是含盐的流动相。另外,装流动相的容器和色谱系统中的在线过滤器等装置应该定期清洗或更换。


5)基线问题

通常情况,基线问题是由于系统或者流动相引起的,和色谱柱关系不大。

可能导致的原因:

1)泵头进气泡

2)系统污染

3)流通池漏液

4)流动相使用的某成分易挥发不稳定检测波长不合适)

5)检测波长低,水的质量不好等等。

6)冲洗保养

当使用了缓冲液或含盐的流动相,实验完成后应用10%的甲醇水溶液冲洗30分钟,洗掉色谱柱中的盐,再用甲醇冲洗30分钟。注意:不能用纯水冲洗柱子,应该在水中加入至少10%的甲醇,防止将填料冲塌陷。还有就是绝对不能在这个工作上面打折扣,否则,一些保留强的杂质没有洗脱下来,只能是给后面的工作带来更大的麻烦。如色谱柱要长时间保存,可以储存于纯甲醇或乙腈中,并将购买新色谱柱时附送的堵头堵上。储存的温度最好是室温。


3、色谱柱的再生

因为色谱柱是消耗品,随着使用时间或进样次数的增加,会出现色谱峰高降低,峰宽加大或出现肩峰的现象,一般来说可能是柱效下降。


依次采用不同极性溶剂冲洗色谱柱,每次20-30倍的色谱柱体积

1)反相色谱柱:

10%甲醇水溶液—乙腈—异丙醇—甲醇—10%甲醇水溶液。

2)正相色谱柱:

正己烷—三氯甲烷—乙酸乙酯—异丙醇—甲醇—异丙醇—乙酸乙酯—三氯甲烷—正己烷

需要注意的是,再生处理正相色谱柱时,所使用的试剂需要严格除水。

3)对于生物类样品污染的色谱柱:

如果生物材料血浆或血清样品注入色谱柱,在大多数情况下,纯有机溶剂如乙腈或者甲醇)并不能溶解肽和蛋白质,用他们清洗色谱柱是无效的。然而,有时使用有机溶剂与缓冲物、酸或离子对试剂的混合物却是有效的。对于HPLC反相柱清洗蛋白质类物质可用下述

组成的溶剂系统:

1%的乙酸水溶液加入5%的甲醇)

1%的三氟乙酸水溶液加入5%的甲醇)

0.1%四氢呋喃/正丙醇=40/60需降低流速)

DMSO/水=50/50或者DMF/水=50/50V/V)。


或者:

将色谱柱反转,与检测器断开,用5倍柱体积的100%异丙醇清洗,然后使用3~5倍柱 体积的二氯甲烷,3~5倍柱体积的异丙醇,最后再返回原始的溶剂体系此操作仅限当色 谱柱寿命快到时使用)。


如果这样处理后柱子还没有好转,说明柱子的寿命已经到了,该更换新的色谱柱了。不过,通常情况下,一根色谱柱的寿命长短,完全取决于应用的样品和分析条件,如果被分析的样品成分以及流动相比较简单,色谱柱的寿命就会比较长,但是相反的,如果被分析样品的成分表较复杂,例如生物样品、中药提取成分等,就会对色谱柱造成很大的影响,导致色谱柱寿命迅速下降。

怎样选择合适的液相色谱柱?

四、结论

综上所述,针对样品的性质以及实验情况,正确的选择一款色谱柱,并且根据色谱柱的 情况正确的使用和维护,才是我们得到好的实验结果和比较长的色谱柱寿命的根本。

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