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液相色谱柱的分类和维护
作者:  浏览量:448  发布时间:2017-08-22 06:02:45

液相色谱柱的分类和维护

一、液相色谱柱概念

色谱是一种分离分析手段,分离是核心,因此担负分离作用的色谱柱是色谱系统的心脏。对色谱柱的要求是柱效高、选择性好,分析速度快等。市售的用于HPLC的各种微粒填料好多孔硅胶以及以硅胶为基质的键合相、氧化铝、有机聚合物微球(包括离子交换树脂)、多孔碳等,其粒度一般为3,5,7,10um等,柱效理论值可达5~16万/米。对于一般的分析只需5000塔板数的柱效;对于同系物分析,只要500即可;对于较难的分离物质对则可采用高达2万的柱子,因此一般10~30cm左右的柱长就能满足复杂混合物分析的需要。


柱效受柱内外因素影响,为使色谱柱达到最佳效率,除柱外死体积要小外,也要有合理的柱结构(尽可能减少填充床以外的死体积)及装填技术。即使最好的装填技术,在柱中心部位和沿管壁部位的填充情况总是不一样的,靠近管壁的部位比较疏松,易产生沟流,流速较快,影响冲洗剂的流形,使谱带加宽,这就是管壁效应。这种管壁区大约是从管壁向内算起30倍料径的厚度。在一般的液相色谱系统中,柱外效应对柱效的影响远远大于管壁效应。


二、液相色谱柱的构造及工作原理

液相色谱柱由柱管、压帽、卡套(密封环)、筛板(滤片)、接头、螺丝等组成。柱管多用不锈钢制成,压力不高于70Kg/cm2 时,也可采用厚壁玻璃或石英管,管内壁要求有很高的光洁度。为提高柱效,减小管壁效应,不锈钢柱内壁多经过抛光。也有人在不锈钢柱内壁涂敷氟塑料以提高内壁的光洁度,其效果与抛光相同还有使用熔融硅或玻璃衬里的,用于细管柱。色谱柱两端的柱接头内装有筛板,是烧结不锈钢或钛合金,孔径0.2-20um(5-10 um),取决于填料粒度,目的是防止填料漏出,柱内径一般是根据柱长、填料粒径和折合流速来确定,目的是为了避免管壁效应。


三、液相色谱柱的发展方向

因强调分析速度而发展出短柱,柱长3~10cm,填料粒径2~3um。为提高分析灵敏度,与质谱(MS)联接,而发展出窄径柱、毛细管柱和内径小于0.2mm的微径柱(MICROBORE)。细管径柱的优点是:①节省流动相;②灵敏度增加;③样品量少;④能使用长柱达到高分离度;⑤容易控制柱温;⑥易于实现LC-MS联用。


但由于柱体积越来越小,柱外效应的影响就更加显著,需要更小池体积的检测器(甚至采用柱上检测),更小死体积的柱接头和连接部件。配套使用的设备应具备如下性能:输液泵能精密输出1~100ul/min的低流量,进样阀能准确、重复地进样微小体积的样品。且因进样量小,要求高灵敏度检测器,电化学检测帮质谱仪在这方面具有突出优点。


四、液相色谱柱的填充

色谱柱的性能除了与固定相性能有关外,还与填充技术有关。在正常条件下,填料粒度>20um 时,干法填充制备柱较为合适;颗粒<20um时,湿法填充较为理想。填充方法一般有四种:①高压匀浆法,多有用于分析柱和小规模制备柱的填充;②径向加压法,Waters 专利;③轴向加压法,主要用于装填大直径柱;④干法,柱填充的技术性强,大多数实验室使用己填充好的商品柱。


必须指出,高效液相色谱柱的获得,装填技术是重要环节,但根本问题还在于填料本身性能的优劣,以及配套的色谱仪系统的结构是否合理。


五、液相色谱柱规格

色谱柱按用途可分为分析型和制备型两类

①常规分析柱(常量柱),内径2~5mm,柱长10~30cm;

②窄径柱(narrow bore),内径1~2mm,柱长10~20cm;

③毛细管柱(又称微柱microcolumn),内径0.2~0.5mm;

④半制备柱,内径>5mm;

⑤实验室制备柱,内径20~40mm,柱长10~30cm;

⑥生产制备柱内径可达几十厘米。


六、对色谱柱详细了解

1、平均颗粒度,颗粒度分布颗粒度(dp)越小:柱效越高(传质好,涡流扩散小)柱压越高(渗透性差)

颗粒分布 颗粒分布越宽∶柱效低(渗透性差)

颗粒形状球型∶柱效高、重现性好、柱床结构均匀

             无定型:柱床结构不均匀 流动相线性速度不均匀,谱带扩展


2、键合相化学

1).影响化合物的分离度:

2).不同键合相对不同种类的化合物分离不同a

3).可能导致色谱的分离机理不同3.如:C18、C8、CN


3、含碳量

1).含碳量越高,k‘值越大(固定相传质效应增加)

2).高含碳量    有利于不易保留的化合物的分离    水解稳定性好,重现性好  有利于极性化合物的拖尾改善

3).低含碳量    有利于分析中性及碱性化合物   降低溶剂损耗   填料的端基封口   封口残余硅羟基

减少不可逆吸附或拖尾    增加碳含量(0.1% - 1%)          

不同色谱柱的含碳量如下所示:

液相色谱柱的分类和维护


4、填料的端基封口     封口残余硅羟基     减少不可逆吸附或拖尾增加碳含量(0.1% - 1%)


5、硅胶的活性

主要影响碱性化合物的保留行为:k',生产硅胶时处理温度不同,硅胶活性也不同,是选择性差异的主要来源,硅胶的杂质含量,重金属含量低,硅羟基活性小,拖尾减小,是色谱柱质量好坏的重要标志,填料的稳定性,硅胶填料,pH:2-8,聚合物填料,pH:2-12,pH值小于2时,键合相水解,液相色谱法能否将某一样品完全分离,主要取决于色谱柱的选择性和柱效,这在很大程度上取决于固定相的选择是否适当。


6、色谱柱的规格:内径    检测的灵敏度、样品的容量

                长度     分离度,理论塔板数   速度   样品的容量    检测的灵敏度


7、柱性能评价:

购买的色谱柱,使用前都要对其性能进行考察,使用期间或放置一段时间后也要重新检查。柱性能指标包括在一定实验条件下(样品、流动相、流速、温度)下的柱压、理论塔板高度和塔板数、对称因子、容量因子和选择性因子的重复性,或分离度。一般说来容量因子和选择性因子的重复性在±5%或±10%以内。进行柱效比较时,还要注意柱外效应是否有变化。


一份合格的色谱柱评价报告应给出柱的基本参数,如柱长、内径、填料的种类、粒度、色谱柱的柱效、不对称度和柱压降等。  


七、色谱柱的使用和维护注意事项

色谱柱的正确使用和维护十分重要,稍有不慎就会降低柱效,缩短使用寿命甚至损坏.在色谱操作过程中,需要注意下列问题,以维护色谱柱。

1、避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况;柱压突然升高或降低也会冲动柱内填料,因此在调节流速时应该缓慢进行,在阀进样时的转动不能过缓(如前所述

2、应逐渐改变溶剂的组成,特别是反相色谱中,不应直接从有机溶剂改变为全部是水,反之亦然。

3、一般说来色谱柱不能反冲,只有生产者指明该柱可以反冲时,才可以反冲除去柱内的杂质.否则反冲会迅速降低柱效.

4、选择使用适宜的流动相(尤其是pH),以避免固定相被破坏.有时可以在进样器前面连接一预柱,分析柱是键合硅胶,预柱为硅胶,可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶"饱和",避免分析柱中的硅胶基质被溶解。

5、避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱骨需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱。保护柱一般是填有固定相的短柱。保护柱可以而且应该经常更换。

6、经常用强溶剂冲洗色谱柱,清除保留在柱内的杂质,在进行清洗时,对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡,每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右,即常规分析需要50-75ml。


下面列举一些色谱柱的清洗溶剂及顺序,作为参考:

正相硅胶柱以正已烷(或庚烷)`二氯甲烷(或氯仿)和甲醇依次冲洗,然后再以相反顺序依次冲洗,所有溶剂都必须严格脱水。甲醇能洗去残留的强极性杂质,已烷使硅胶表面重新活化。


反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷(或氯仿)依次冲洗,再以相反顺序依次冲洗。如果下一步分析用的流动相不含缓冲液,那么可以省略最后一步用水冲洗。一氯甲烷能洗支残留的非极性杂质。四氢呋喃与乙腈或甲醇的混全溶液能除去类脂。有时也注射二甲亚砜数次。此外,用乙腈、丙酮和三氟醋酸(0.1%)梯度洗能除去蛋白质污染。


阳离子交换柱可用稀酸缓冲液冲洗,阴离子交换柱可用稀碱缓冲液冲洗,除去交换性能强的盐,然后用水、甲醇、水依次冲洗。


7、保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇,柱接头要拧紧,防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。


8、色谱柱使用过程中,如果压力升高,一种可能是烧结滤片被堵塞,这时应更换滤片或将其取出进行清洗;另一种可能是大分子进入柱内,使柱头被污染;如果柱效降低或色谱峰变形,则可能柱头出现塌陷,死体积增大。


通常色谱柱寿命在正确使用时可达2年以上。以硅胶为基质的填料,只能在pH2~9范围内使用。柱子使用一段时间后,可能有一些吸附作用强的物质保留于柱顶。新的色谱柱在使用一段时间后柱顶填料可能塌陷,使柱效下降。 每次工作完后,最好用洗脱能力强的洗脱液冲洗,例如ODS柱宜用甲醇冲洗至基线平衡。当采用盐缓冲溶液作流动相时,使用完后应用无盐流动相冲洗。含卤族元素(氟、氯、溴)的化合物可能会腐蚀不锈钢管道,不宜长期与之接触。装在HPLC仪上柱子如不经常使用,应每隔4~5天开机冲洗15分钟。


9、柱的保养:当柱子和色谱仪联结时,阀件或管路一定要清洗干净;

要注意流动相的脱气;

避免使用高粘度的溶剂作为流动相;

进样样品要提纯;

严格控制进样量;

每天分析工作结束后,要清洗进样阀中残留的样品;

每天分析测定结束后,都要用适当的溶剂来清洗柱;

若分析柱长期不使用,应用适当有机溶剂保存并封闭;

 液相色谱柱的分类和维护


八、正相色谱法与反相色谱法比较表

                       正相色谱法                   反相色谱法

固定相极性                高~中                       中~低

流动相极性                低~中                       中~高

组分洗脱次序              极性小先洗出               极性大先洗出

从上表可看出,当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界线(如氨基键合固定相)。

1、色谱柱的使用说明

1)、色谱柱使用前注意事项:

色谱柱的储存液无特殊说明,均为评价报告所示的流动相。在使用前,一定要注意色谱柱的储存液与要分析样品的流动相是否互溶。在反相色谱中,如用高浓度的盐或缓冲液作洗脱剂,应先用10%左右的低浓度的有机相洗脱剂过渡一下,否则缓冲液中的盐在高浓度的有机相中很容易析出,堵塞色谱柱。


2)、流动相:

流动相中所使用的各种有机溶剂要尽可能使用色谱纯,配流动相的水最好是超纯水或全玻璃器皿的双蒸水。如果将所配得流动相再经过0.45μm的滤膜过滤一次则更好,尤其是含盐的流动相。另外,装流动相的容器和色谱系统中的在线过滤器等装置应该定期清洗或更换。

以常规硅胶为基质的键合相填料通常的pH值适用范围是2.0-8.0,BDS C18适合于碱性化合物,pH值适用范围为2.0-10.0。当必须要在pH值适用范围的边界条件下使用色谱柱时,每次使用结束后立即用适合于色谱柱储存并与所使用的流动相互溶的溶剂清洗,并完全置换掉原来所使用的流动相。


3)、样品:

样品也要尽可能清洁,可选用样品过滤器或样品预处理柱(SPE)对样品进行预处理;若样品不便处理,要使用保护柱。在用正相色谱法分析样品时,所有的溶剂和样品应严格脱水。

色谱柱的保存


4)、反相色谱柱每天实验后的保养:

使用缓冲液或含盐的流动相,实验完成后应用10%的甲醇/水冲洗30分钟,洗掉色谱柱中的盐,再用甲醇冲洗30分钟。注意:不能用纯水冲洗柱子,应该在水中加入10%的甲醇,防止将填料冲塌陷。


5)、长期保存色谱柱:

如色谱柱要长时间保存,必须存于合适的溶剂下。对于反相柱可以储存于纯甲醇或乙腈中,正相柱可以储存于严格脱水后的纯正己烷中,离子交换柱可以储存于水(含防腐剂叠氮化钠或柳硫汞)中,并将购买新色谱柱时附送的堵头堵上。储存的温度最好是室温。


6)、色谱柱的再生

因为色谱柱是消耗品,随着使用时间或进样次数的增加,会出现色谱峰高降低,峰宽加大或出现肩峰的现象,一般来说可能是柱效下降。


7)、反相柱的再生:依次采用20-30倍的色谱柱体积的甲醇:水=10:90 (V/V),乙腈,异丙醇作为流动相冲洗色谱柱,完成后再以相反顺序冲洗色谱柱。


正相柱的再生:依次以20-30倍色谱柱的体积的正己烷、异丙醇、二氯甲烷、甲醇作为流动相冲洗色谱柱,然后再以相反的顺序冲洗色谱柱。要注意上述溶剂必须严格脱水。


九、液相色谱柱在使用过程中易出现的问题和解决办法

1、液相色谱柱在使用过程中易出现的问题

色谱柱在使用中最常见的问题就是柱压升高,如果柱压是在长时间使用过程中缓慢增加,属于正常现象。但柱压在使用过程中突然升高(系统管路堵塞及压力传感器故障除外),可能的原因有如下几点:

1)、色谱柱头的过滤筛板堵塞或污染;

2)、色谱柱头的填料被样品污染;

3)、色谱柱内缓冲液中的盐遇到高浓度的甲醇或其他有机溶剂,形成结晶析出;

4)、流动相PH值过大或过小使固定相结构破坏或溶解;


2、液相色谱柱在使用过程中易出现的问题的解决办法如下:

1)、如确定是色谱柱头的过滤筛板被污染,可以将色谱柱反方向用甲醇冲洗至正常压力,或者卸下色谱柱头,将其放在10%的稀硝酸内超声清洗10分钟,后再用纯水超声10分钟,重新装入色谱柱。

2)、如确定色谱柱头的填料被污染,将柱头螺丝卸下,挖出柱内前段被污染的填料,用相同的柱填料重新填入,仔细修复后,重新安装上柱头螺丝。

3)、如确定定是盐结晶,用10%的甲醇/水冲洗色谱柱使柱内盐全部溶解,再换高浓度甲醇。

4)、如果因pH值使用不当,很难恢复。


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