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药物牛黄上清丸中4种蒽醌类化合物的含量检测高效液相色谱仪
作者:  浏览量:1081  发布时间:2017-12-20 10:25:33

药物牛黄上清丸中4种蒽醌类化合物的含量检测

一、概述

牛黄上清丸,中成药名。为清热剂,具有清热泻火,散风止痛之功效。用于热毒内盛、风火上攻所致的头痛眩晕、目赤耳鸣、咽喉肿痛、口舌生疮、牙龈肿痛、大便燥结。由人工牛黄、薄荷、菊花、荆芥穗、白芷、川芎、栀子、黄连、黄柏、黄芩、大黄、连翘、赤芍、当归、地黄、桔梗、甘草、石膏、冰片等组成。其中大黄主要含蒽醌、二蒽酮类及其衍生物,蒽醌类具有止血、抗菌、泻下、利尿的作用,能刺激肠道神经丛,促进肠蠕动。但是蒽醌成分具有肝毒性和肾毒性,还有一定的致癌作用。本文建立了液相色谱仪对药物牛黄上清丸中4种蒽醌类化合物的含量测定方法,测定其中蒽醌类化合物的含量。


二、药物牛黄上清丸中4种蒽醌类化合物的含量检测液相色谱仪器简介

LC-600A智能全控液相色谱仪(南京科捷分析仪器有限公司、由P600高压恒流泵与UV600紫外检测器直接构成等度分析系统。使用WS600工作站可以同时控制数台P600高压恒流泵、UV600紫外检测器及恒温柱箱等,具备多元高压洗脱、波长扫描等功能;广泛应用于研究开发、医药检验、食品检测、化工分析、环境监测等众多分析领域。

1、往复式并联泵设计,流量精度高,压力脉动小,延长密封圈和活塞杆的使用寿命;

2、整体性单向阀,结构简单,密封性好;

3、平行双锥孔设计的流动池,大幅提高信噪比,检测效果更佳;

4、柱塞杆自动缩进,方便更换密封圈;

5、可选配柱后清洗功能,适用于使用含缓冲盐的分析条件。

6、隔膜式脉冲阻尼器与电子脉动抑制技术同时控制压力脉动保障最低的基线噪音;7、开机自检功能,通过图谱上486.6nm和656nm这二点的位置,以判断波长示值误差的准确性,保证极优的波长精度,保障仪器最佳状态;

8、控制电路采用多微处理器结构,分别管理信号采集、数据处理,系统控制和通信。在做等度分析时,可以方便地通过全汉字的液晶屏与七个功能键,设置波长、滤波常数、输出量程,运行时间等参数。并且可以实现开关氘灯,光谱扫描,启动分析程序等功能;

9、全数字交换系统,避免了色谱信号需要多重摸-数转换带来的信号畸变与干扰。


三、样品处理:

准确称取1.0g试样,置于100mL具塞提取瓶中,加入25mL甲醇,于超声波发生器中提取2h。将提取液经0.45μm滤膜过滤后,转移至液相色谱进样小瓶中,作为待测样品。


药物牛黄上清丸中4种蒽醌类化合物的含量检测液相色谱仪的色谱条件:

   色谱柱

KromasilC18150mm×4.6mm5μm

   流动相

甲醇:0.5%磷酸=75%25%

   流速

1.0mL/min

   柱温

30

   检测波长

230nm

   进样量

10μL









色谱图示:

药物牛黄上清丸中4种蒽醌类化合物的含量检测液相色谱仪


四、方法与结果

1、对照品溶液的制备

分别精密称取对照品绿原酸、栀子苷、盐酸小檗碱、黄芩苷、大黄素和大黄酚适量,精密定,置于同一10mL量瓶中,用甲醇定容并混匀,制成含绿原酸0.011mg·mL-1、栀子苷0.48mg·mL-1、盐酸小檗碱0.073mg·mL-1、黄芩苷0.1mg·mL-1、大黄素0.004mg·mL-1、大黄酚0.01mg·mL-1的混合对照品溶液。


2、供试品溶液的制备

将牛黄上清丸大蜜丸剪碎,称取1.0g置蒸馏瓶中,精密加稀甲醇40mL,称定质量,超声处理30min,超声功率为250W,频率为40KHz,置水浴上回流3h,放冷,称定质量,用稀甲醇补足减失的重量,静置,取上清液,经0.45μm微孔滤膜过滤,即得供试品溶液。AgilentHC-C18(4.6mm×250mm,5μm)WondaSil-C18。


3、阴性样品溶液的制备

按处方制备阴性对照溶液。分别制备不含菊花和栀子的阴性对照溶液;不含栀子的阴性对照溶液;不含黄连、黄柏的阴性对照溶液;不含黄芩的阴性对照溶液、不含大黄的阴性对照溶液。


4、色谱条件

色谱柱:DIKMAPlatisilODS色谱柱(4.6mm×250mm,5μm);流动相为甲醇(A)-0.1%磷酸水溶液(B),梯度洗脱(0~5min,40%~40%A;5~10min,40%~55%A;10~16min,55%~55%A;16~35min,55%~90%A;35~52min,90%~90%A),流速为1mL·min-1,柱温30℃,检测波长为254nm,进样10μL,各待测组分分离度均大于1.5、理论塔板数均大于5000。混合对照品溶液、样品溶液及各阴性对照溶液色谱图见图1。


5、线性考察

精密吸取混合对照品溶液1,5,8,10,15,20μL分别注入HPLC以峰面积(Y)为纵坐标,进样量(X)为横坐标进行线性回归,得绿原酸、栀子苷、盐酸小檗碱、黄芩苷、大黄素、大黄酚的线性回归方程结果见表1。

1-绿原酸;2-栀子苷;3-盐酸小檗碱;4-黄芩苷;5-大黄素;6-大黄酚

药物牛黄上清丸中4种蒽醌类化合物的含量检测液相色谱仪

图1牛黄上清丸测定中混合对照品(A)、样品(B)、不含菊花和栀子的阴性样品(C)、不含栀子的阴性样品(D)、不含黄连、黄柏的阴性样品(E)、不含黄芩的阴性样品(F)、不含大黄的阴性样品(G)在254nm处色谱图。


6、精密度实验

取混合对照品溶液,按“2.4”项下色谱条件连续进样6次,测得混合对照品中绿原酸、栀子苷、盐酸小檗碱、黄芩苷、大黄素、大黄酚峰面积RSD(n=6)分别为0.32%,0.22%,0.15%,0.19%,0.27%,0.31%。


7、稳定性实验

取同一供试品溶液,室温放置,分别于0,2,4,6,12,24h进行测定,测得绿原酸、栀子苷、盐酸小檗碱、黄芩苷、大黄素、大黄酚的峰面积的RSD(n=6)分别为0.94%,0.78%,0.53%,0.49%,0.85%,1.1%,表明供试品溶液在常温下24h内稳定。


8、重复性实验

取牛黄上清丸样品,按“2.2”项下供试品溶液配制方法平行制备6份供试品溶液,以“2.4”项下色谱条件进行测定,得绿原酸、栀子苷、盐酸小檗碱、黄芩苷、大黄素、大黄酚的平均含量(n=6)分别为0.619,1.562,1.074,4.427,0.053,0.152mg·g-1;RSD分别为0.81%,1.02%,0.74%,0.79%,0.91%,1.07%。


9、加样回收率

精密称取已知含量样品约0.5g,共9份,分为3组,按低、中、高浓度分别加入绿原酸(0.31mg·mL-1)0.8,1,1.2mL;栀子苷(0.78mg·mL-1)0.8,1,1.2mL;盐酸小檗碱(0.54mg·mL-1)0.8,1,1.2mL;黄芩苷(2.22mg·mL-1)0.8,1,1.2mL;大黄素(0.03mg·mL

-1)0.8,1,1.2mL;大黄酚(0.08mg·mL-1)0.8,1,1.2mL。按照“2.2”项下方法制备溶液,进样10μL进行测定,结果见表2。


10、耐用性实验

通过对流动相比例、流速和柱温的少量改变及另换AgilentHC-C18和WondaSil-C18柱(4.6mm×250mm,5μm)以考察本法的耐用性,结果发现,柱效和分离度无明显的变化,说明本法的耐用性良好。


11、样品含量测定

取一定量3批样品,按“2.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.4”项下进行分析,结果见表3。

药物牛黄上清丸中4种蒽醌类化合物的含量检测液相色谱仪


五、讨论

牛黄上清丸、牛黄上清片、牛黄上清胶囊这3种中药制剂因处方、主治与功能等基本相同,在临床用药时常作为同一种药物来使用,因此应具有相对统一的质量标准,这个问题已经有过报道,笔者通过实验确定了同时测定牛黄上清丸中多种成分含量的色谱条件,涵盖了本中药制剂3种不同剂型在药典中所规定的含量测定成分,是一种简便、准确、快捷的定量方法,可以更好的控制其制剂的质量。在流动相的选择上,已有测定此种中药制剂多是单组分或两种组分的测定,多选择乙腈-水系,笔者考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-磷酸水、甲醇-磷酸水4个溶剂系统,结果发现,甲醇-水为流动相时,几个目标峰拖尾都较严重,分离效果较差。采用乙腈-水时,绿原酸和栀子苷分不开,黄芩苷和杂质峰重合。采用乙腈-磷酸水时,绿原酸、栀子苷分和黄芩苷分离度不好。只有甲醇-磷酸水可以获得符合要求的峰形和分离度。


在波长的选择上,波长扫描得到绿原酸、栀子苷、盐酸小檗碱、黄芩苷、大黄素、大黄酚最大吸收波长分别为327、240、345、278、254、254nm。如果选择278、327、345nm波长时,在35min以后由于梯度洗脱流动相比例变化太大,基线会产生很大的漂移,从而影响大黄素、大黄酚的分离度和峰的拖尾因子。选择240nm波长对绿原酸的分离影响较大,出峰较小,故选择254nm作为检测波长。



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