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高效液相色谱法测定茶叶中的咖啡因
作者:  浏览量:745  发布时间:2017-08-25 05:35:20

高效液相色谱法测定茶叶中的咖啡因

一、概述

茶叶中咖啡因的含量是衡量茶叶质量的重要指标之一,也具有多种药理活性。咖啡因又名咖啡碱,属甲基黄嘌呤化合物,具有提神醒脑等刺激中枢神经的作用。茶叶中多种药用成分的分析是个热门的研究。对于茶叶中咖啡因含量测定方法常用的有:紫外分光光谱法,高效液相色谱法等。本文建立了高效液相色谱法(HPLC)测定了茶叶中的咖啡因方法便捷、准确和实用,是值得推荐的检测方法。


二、高效液相色谱法测定茶叶中的咖啡因试剂与仪器准备

绿茶(市售)、LC600A液相色谱仪(南京科捷分析仪器有限公司)脱气装置、SPD10A紫外检测器、LC10AD泵、SCL10A系统控制器),甲醇、DMF和THF均为色谱纯,无水柠檬酸为分析纯(浙江生产),其他试剂均为分析纯,二次重蒸水。


三、高效液相色谱法测定茶叶中的咖啡实验方法

1、色谱条件

色谱柱:4.6mmX250.0mm,5.0μm

流动相:0.04mol/L

柠檬酸水溶液:N,N-二甲基甲酰胺(DMF):四氢呋喃(THF)=90:16:4;

流速:1.00ml/min;

柱温:60;检测波长:280nm;进样量:10l。


2、样前处理

将茶叶置于80℃烘箱中烘干,然后将茶叶磨碎,准确称取一定量茶叶于250ml锥形瓶中,加入100ml沸蒸馏水,超声提取,静置过夜,取上清液定容于500ml容量瓶中,用0.45m有机相滤膜过滤,即得样品溶液,供HPLC分析。称取一定量的茶叶,在35~45℃水浴上用乙醇浸提1h,蒸发浓缩得粗咖啡因,升华法纯化后作为标准品。


3、高效液相色谱法测定茶叶中的咖啡因之纯化咖啡因含量测定

称取升华所得咖啡因,用流动相配成一定浓度的溶液进样分析,并用归一化法计算咖啡因的纯度。


4、标准储备液的配制

准确称取升华的咖啡因0.205g,用流动相溶解并定容到100ml容量瓶中,摇匀。准确移取上述溶液5.00m,l用流动相定容到50ml容量瓶中,摇匀,即得标准储备液(200.0g/ml)。


5、标准系列溶液的配制和样品的测定

精密吸取标准储备液0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00m,l分别加入10ml容量瓶中,用流动相定容至刻度,摇匀,即得浓度为0、20、40、60、80、100g/ml的标准系列溶液,以0.45m有机相滤膜过滤。按上述色谱条件进样10,l以峰面积A为纵坐标,标准品咖啡因的浓度为横坐标制标准曲线。


按上述色谱条件,注入样品溶液10,l测得峰面积,按标准曲线计算即得样品中咖啡因含量。


四、高效液相色谱法测定茶叶中的咖啡实验结果分析

1、提取时间的选择

考察了超声提取时间5、10、15、20、25min5个不同时间所提取咖啡因的含量,得最佳超声提取时间为15min,故样品选用了超声15min提取咖啡因。


2、流动相的选择

分别以甲醇醋酸=4060,甲醇水=0.30,水:磷酸:乙腈DMF=85:91:12020,0.04mol/L柠檬酸

水溶液N,N二甲基甲酰胺(DMF)四氢呋喃(THF)=90:164(体积比)为流动相进行茶叶中成分分析,得到以0.04mol/L柠檬酸水溶液N,N二甲基甲酰胺(DMF)四氢呋喃(THF)=90164为流动相效果最佳。因为该测定条件下咖啡因与茶叶中的其他物质色谱峰都能很好地分开,互不干扰,咖啡因的色谱峰的保留时间为5.078min。


3、标准曲线的线性范围

在上述测定条件下,在20~100g/ml的范围内,咖啡因的浓度与色谱峰面积有很好的线性关系,其线性回归方程为:y=27634x-603.62,回归系数:r=0.9999,标准曲线见图1。

高效液相色谱法测定茶叶中的咖啡因



4、纯化咖啡因含量测定

在上述测定条件下得色谱图,如图2所示。用归一化法计算升华得咖啡因的纯度为97.41%。

高效液相色谱法测定茶叶中的咖啡因


5、精密度试验

按上述样品处理和测定对该方法进行精密度试验,咖啡因的5次测定结果依次为71.4、71.3、71.0、71.1、71.2g/m,l平均值为71.2g/ml。图3为样品色谱图,变异系数(CV)为0.23%。

图片5

6、方法的回收率试验

在样品中分别加入咖啡因20、30、40g,测定其回收率(5次),结果见表2。结果显示,回收率在98.9%~102.3%。

高效液相色谱法测定茶叶中的咖啡因

五、总结

本文建立了以0.04mol/L柠檬酸水溶液N,N二甲基甲酰胺(DMF)四氢呋喃(THF)=90164为流动相,ZorbaxC8(4.6mm250.0mm,5.0m)为色谱柱分析茶叶中咖啡因的高效液相色谱法。对方法的精密度、稳定性、重复性和回收率进行考察,结果证明该高效液相色谱法测定茶叶中的咖啡因分析方法具有良好的线性、精密度和回收率。此法快速、可靠、简单,适用于茶叶和茶饮料中咖啡因含量的测定。


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