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高效液相色谱仪的组成及分类
作者:  浏览量:907  发布时间:2017-10-09 04:15:21

高效液相色谱仪的组成及分类

液相色谱法是分析化学中发展最快、应用最广的一种分析方法,特别是高效液相色谱仪已经成为生命科学、材料科学、环境科学等方面必不可少的重要检测方法。现代科学技术的发展使得分析对象越来越复杂,分析要求越来越高,液相色谱的强大功能使其成为新世纪中解决生命科学、材料科学、环境科学等复杂体系发现难题的最有力的技术和方法。


高效液相色谱仪它是在经典液相色谱的基础上,引入气相色谱的理论和技术而发展起来的。在高效液相色谱中,流动相与组分之间有一定的亲和力,分离过程的实现是组分、流动相和固定相三者间相互作用的结果,分离不但取决于组分和固定相的性质,还与流动相的性质密切相关,一般情况下,高效液相色谱仪的分析可在室温下进行,由于采用颗粒极细的固定相,柱内压降很大,加上流动相黏度高,因此必须采用高入口压,以此来维持一定的流动相线速。高效液相色谱仪对于挥发性低、热稳定性差、分子量大的物质特别有利,它在医药、生化等方面具有非常重要的作用。


一、高效液相色谱仪的组成

高效液相色谱仪是实现液相色谱分析的设备。高效液相色谱仪主要由贮液器、脱气器、高压泵、进样器、色谱柱和检测器等组成。

1、脱气器

脱气的目的是为了防止流动相从高压柱内流出时释放出气泡进入检测器而使噪声剧增,至使不能正常检测,一般情况下通常采用氦气鼓泡来驱除流动相中溶解的气体,因为氦气在各种液体中的溶解度极低,所以必须先用氯气快速清扫溶剂数分钟,然后再使氦气以极小流量不断流过此溶剂。


2、贮液器

贮液器是用于存放溶剂的装置。贮液器中的溶剂必须很纯,贮液器材料要耐腐蚀,对溶剂呈惰性,一般情况下通常采用1升~2升的大容量玻璃瓶,也可采用不锈钢制成的容器,贮液器应配有溶剂过滤器,以防止流动相中的颗粒进入泵内,溶剂过滤器一般用耐腐蚀的镍合金制成,孔隙大小一般为2μm。


3、高压泵

泵应耐压、耐腐蚀、密封性好。高压泵主要用于输送流动相,其压力一般为几兆帕至数十兆帕。这是液体的黏度比气体大 100 倍,同时由于固定相的颗粒极细,柱内压降大,为保证一定的流速,必须借助高压迫使流动相通过柱子。高压泵应无脉动或脉动极小,以保证输出的流动相具有恒定的流速,同时采用脉动阻尼装置可将产生的脉动除去,使流动相的流量变动范围不宜超过 2%~3%。高压泵主要分为恒压泵、恒流泵和螺旋传动注射泵三类。


1)恒压泵

恒压泵输出的压力恒定,当具有一定压力的气体作用在一个大面积活塞上,大面积活塞再驱动一个小面积活塞,小面积活塞承受的压力是大面积活塞的几十倍,从而得到压力恒定的流出液。


2)恒流泵

恒流泵的主要功能是输出的流量恒定,如往复柱塞泵、螺旋传动注射泵等。往复柱塞泵与恒压泵不同,通常采用电驱动活塞,当活塞迅速向上动时,由于减压使入口止逆阀开启,出口止逆阀关闭,贮液器中的流动相被吸入柱内,形成一个循环,然后再开始下一个循环。使用这种泵时一定要连接脉动阻尼器,将产生的脉动除去,若采用双活塞泵,使双活塞在相移180°下工作,可使脉动互相抵消,减小噪声。往复柱塞泵的流量与外界阻力无关,恒流泵具有体积小的特点,非常适合于梯度洗脱。


3)螺旋传动注射泵

螺旋传动注射泵是用电力以很慢的恒定速率驱动活塞,使流动相连续输出,当活塞到达末端时,输出中止,然后由另一个吸入冲程使溶剂重新充满再开始第二次输出,输出时间的长短决定于泵腔体积及输出流量。


4、梯度洗脱

梯度洗脱是在分离过程中通过逐渐改变流动相的组成增加洗脱能力的一种方法。通过梯度装置将两种或三种、四种溶剂按一定比例混合进行二元或三元、四元梯度洗脱。梯度洗脱一

般采用低压梯度的方法,低压梯度采用低压混合设计,只需要一个高压泵在常压下将两种或两种以上溶剂按一定比例混合后再由高压泵输出,梯度的改变可呈线性、指数型或阶梯型。


5、进样器

高效液相色谱仪进样器普遍使用高压进样阀,用微量注射器将样品注入样品环管,使用的样品环管分别有不同的尺寸,可根据分析要求选用。当进样阀手柄放在吸液位置时,流动相直接通过孔的通路流向色谱柱,样品通过注射器从另外的位置进入样品环管,如果有过量的样品则会从出口孔排出,然后将手柄转到进样位置,此时流动相便将样品带进了柱子。


6、色谱柱

色谱柱是整个色谱系统的心脏,它的质量优劣直接影响到分离的效果,一般情况下色谱柱通常采用优质不锈钢管制成,并且柱内壁必须光洁平滑,否则内壁的纵向沟痕和表面多孔性也会引起谱带的展宽,柱接头的体积应尽可能小,柱长一般为 10 cm ~25cm,内径 4 mm ~5mm。若使用直径为5μm~10μm 固定相颗粒,理论塔板可达到 5×10 4 /m。尺寸排阻色谱柱的内径通常大于 5mm,制备色谱柱则会更大 ;为了减少溶剂用量,可采用微径柱,内径为 1mm,长度为 30mm ~75mm,若采用 3μm 颗粒,理论塔板数高达 1×10 5 /m。

为了保护分析柱不被污染,有时需在分析柱前加一短柱,约数厘米长,此柱称为卫柱,为了防止卫柱过分增加柱阻力,在卫柱中使用的颗粒大小约为 10μm ~30μm。


7、检测器

高效液相色谱仪常用的检测器有紫外吸收、示差折光率、荧光和安培检测器等,对它们的要求和性能指标与气相色谱检测仪基本相同。检测器主要分为紫外吸收检测器、荧光检测器和示差检测器。


1)紫外吸收检测器

紫外吸收检测器是一种选择性浓度型检测器,它不仅对那些在紫外波长下有吸收的物质有响应,并且还具有灵敏度高、噪声低等优点,在高效液相色谱中应用最广,约占70%。紫外吸收检测器通常采用氘灯作光源,氘灯发射出紫外线并在可见区范围内可以进行连续的辐射,同时安装一个光栅型单色器,通过扫描获得所需的工作波长,检测器它有两个流通池,一个作参比用,一个作测量用,光源发出的紫外光照射到流通池上,若两流通池通过纯的均匀溶剂,它们在紫外波长下几乎无吸收,光电管上接收到的辐射强度则相等,无信号输出 ;当组分进入测量池时,吸收一定的紫外光,使两光电管接受到的辐射强度不等,这时有信号输出,输出信号的大小与组分浓度有关,紫外吸收检测器的灵敏度很高,许多功能团在紫外区具有很高的摩尔吸收系数,若采用可调波长的氘灯作光源,在组分的最大吸收波长处进行检测,其检测灵敏度可达 0.002AUFS(满刻度吸收单位),最小检测量为几个 ng。紫外吸收检测器适用于梯度洗脱,对流动相速度变化不敏感,流动相组成的变化对检测响应几乎无影响,但是只有在检测器所提供的波长下有较大吸收的分子才能进行检测,而且流动相的选择会受到一定限制,即具有一定紫外吸收的溶剂不能作流动相。每种溶剂都有紫外截止波长。当

小于该截止波长的紫外光通过溶剂时,溶剂的透光率才能降到 10% 以下。因此检测器的工作波长不能小于溶剂的紫外截止波长。从氘灯发出的紫外 - 可见辐射穿过光闸,光闸是惟

一可以移动的部件,它用于暗电流的测量和波长的校正,此辐射不经分光直接通过吸收池、狭缝至衍射光栅经光栅分光的辐射分别投射到约千个二极管阵列的检测器上,约 10ms可以测出一次信号,获得数据如此高速,可以使保留时间极短的色谱组分的光谱图不失真,固定光栅和二极管阵列可以消除因机械传动的不确定性而带来的误差,并且此数据的重现性好,灵敏度高,适用于痕量分析,这种检测器的最大优点是可以同时获得吸收值,其保留时间和波长函数图类似于等高线的三维图。由于可以同时获得多种信息,使每个组分在整个波长范围内的光谱信息将会增加,而且可以及时观察与每一组分的色谱图相应的光谱数据,从而迅速决定具有最佳选择性和灵敏度的波长,它可以与色谱工作站联用,通过评估程序可以从比较光谱图获得样品纯度的信息,而且可对每一个峰从程序库中进行检索来确定该化合物。


2)荧光检测器

荧光检测器是一种最灵敏的高效液相色谱检测器。它属于选择性浓度型检测器,光源发出的光束通过透镜和激发滤光片,分离出特定波长的紫外光,此波长称为激光波长,再经聚焦透镜聚集于吸收池上,此时荧光组分被紫外光激发而产生荧光,在与光源垂直的方向上经聚焦透镜与荧光聚焦,再通过发射滤光片分离出发射波长,并投射到光电倍增管上,荧光强度与组分浓度成比例,荧光检测器的灵敏度比紫外吸收检测器约高二个数量级,因此特别适合于痕量分析,非荧光物质可通过与荧光试剂反应变成荧光物质后再进行检测,使荧光检测器扩大了该检测器的应用范围。


3)示差折光率检测器

示差折光率检测器是一种通用性检测器,只要组分折光率与流动相折光率不同,就能进行检测。反射型示差折光率检测器根据Fresnel反射定律设计,光源发出的光束分别投射到测量池和参比池上,其中有一部分入射光在液体和棱镜界面上就被反射出来,而另一部分则穿过液体后被棱镜底部的不锈钢板反射出来,投射到光电管上。由于流经参比池和测量池的液体的折光率不等,因此反射出来的两束光强就有差别,导致光电管产生信号。示差折光率检测器的通用性好,可以检测的化合物范围广 ,特别是在尺寸排阻色谱中用得较多。


二、高效液相色谱仪的分类

高效液相色谱仪根据检测器的不同而被分类,被紫外可见吸收检测器高效液相色谱仪、光电二极管阵列检测器高效液相色谱仪、荧光检测器高效液相色谱仪、示差折光检测器高效液相色谱仪、电化学检测器高效液相色谱仪与化学发光检测器高效液相色谱仪等六大类。


1、紫外可见吸收检测器

紫外可见吸收检测器(UVD)是HPLC中应用最广泛的检测器之一,几乎所有的液相色谱仪都配有这种检测器。其特点是灵敏度较高,线性范围宽,噪声低,适用于梯度洗脱,对强吸收物质检测限可达1ng,检测后不破坏样品,可用于制备,并能与任何检测器串联使用。紫外可见检测器的工作原理与结构同一般分光光度计相似,实际上就是装有流动地的紫外可见光度计。


紫外吸收检测器常用氘灯作光源,氘灯则发射出紫外-可见区范围的连续波长,并安装一个光栅型单色器,其波长选择范围宽(190nm~800nm)。它有两个流通池,一个作参比,一个作测量用,光源发出的紫外光照射到流通池上,若两流通池都通过纯的均匀溶剂,则它们在紫外波长下几乎无吸收,光电管上接受到的辐射强度相等,无信号输出。当组分进入测量池时,吸收一定的紫外光,使两光电管接受到的辐射强度不等,这时有信号输出,输出信号大小与组分浓度有关。


局限:流动相的选择受到一定限制,即具有一定紫外吸收的溶剂不能做流动相,每种溶剂都有截止波长,当小于该截止波长的紫外光通过溶剂时,溶剂的透光率降至10%以下,因此,紫外吸收检测器的工作波长不能小于溶剂的截止波长。


2、光电二极管阵列检测器

光电二极管阵列检测器也称快速扫描紫外可见分光检测器,是一种新型的光吸收式检测器。它采用光电二极管阵列作为检测元件,构成多通道并行工作,同时检测由光栅分光,再入射到阵列式接收器上的全部波长的光信号,然后对二极管阵列快速扫描采集数据,得到吸收值(A)是保留时间(tR)和波长(l)函数的三维色谱光谱图。由此可及时观察与每一组分的色谱图相应的光谱数据,从而迅速决定具有最佳选择性和灵敏度的波长。


单光束二极管阵列检测器,光源发出的光先通过检测池,透射光由全息光栅色散成多色光,射到阵列元件上,使所有波长的光在接收器上同时被检测。阵列式接收器上的光信号学的方法快速扫描提取出来,每幅图象仅需要10ms,远远超过色谱流出峰的速度,因此可随峰扫描。


3、荧光检测器

光检测器是一种高灵敏度、有选择性的检测器,可检测能产生荧光的化合物。某些不发荧光的物质可通过化学衍生化生成荧光衍生物,再进行荧光检测。其最小检测浓度可达0.1ng/ml,适用于痕量分析;一般情况下荧光检测器的灵敏度比紫外检测器约高2个数量级,但其线性范围不如紫外检测器宽。


近年来,采用激光作为荧光检测器的光源而产生的激光诱导荧光检测器极大地增强了荧光检测的信噪比,因而具有很高的灵敏度,在痕量和超痕量分析中得到广泛应用。


4、示差折光检测器

示差折光检测器是一种浓度型通用检测器,对所有溶质都有响应,某些不能用选择性检测器检测的组分,如高分子化合物、糖类、脂肪烷烃等,可用示差检测器检测。示差检测器是基于连续测定样品流路和参比流路之间折射率的变化来测定样品含量的。光从一种介质进入另一种介质时,由于两种物质的折射率不同就会产生折射。只要样品组分与流动相的折光指数不同,就可被检测,二者相差愈大,灵敏度愈高,在一定浓度范围内检测器的输出与溶质浓度成正比。


5、电化学检测器

电化学检测器主要有安培、极谱、库仑、电位、电导等检测器,属选择性检测器,可检测具有电活性的化合物。目前它已在各种无机和有机阴阳离子、生物组织和体液的代谢物、食品添加剂、环境污染物、生化制品、农药及医药等的测定中获得了广泛的应用。其中,电导检测器在离子色谱中应用最多。


电化学检测器的优点是:

①灵敏度高,最小检测量~般为ng级,有目可达pg级;

②选择性好,可测定大量非电活性物质中极痕量的电活性物质;

③线性范围宽,一般为4~5个数量级;

④设备简单,成本较低;

⑤易于自动操作。


6、化学发光检测器

化学发光检测器是近年来发展起来的一种快速、灵敏的新型检测器,因其设备简单、价廉、线性范围宽等优点。其原理是基于某些物质在常温下进行化学反应,生成处于激发态势反应中间体或反应产物,当它们从激发态返回基态时,就发射出光子。由于物质激发态的能量是来自化学反应,故叫作化学发光。当分离组分从色谱柱中洗脱出来后,立即与适当的化学发光试剂混合,引起化学反应,导致发光物质产生辐射,其光强度与该物质的浓度成正比。

这种检测器不需要光源,也不需要复杂的光学系统,只要有恒流泵,将化学发光试剂以一定的流速泵入混合器中,使之与柱流出物迅速而又均匀地混合产生化学发光,通过光电倍增管将光信号变成电信号,就可进行检测。这种检测器的最小检出量可达10-12g。


三、液相色谱仪的进展

二维色谱联用技术主要是在二种色谱之间采用柱切换技术,用多通切换阀来改变色谱柱之间的连接和溶剂流向,实现将一根色谱柱上未分开的组分在另一根柱上用不同的分离原理加以完全分离,尤其适合复杂体系样品的分析。将样品的预处理、分离反应、检测、收集等一个实验室的功能聚集在一个小块玻璃或高分子聚合物芯片上,微流控芯片在芯片基质上蚀刻了各种管道和反应池。通过电渗透、微泵乃至离心等各种方法来实现分离,如测 DNA 序列的芯片在 3cm 距离内,只加 20V/cm 的电压就可在 13 分钟内测定 40BP 的序列,分离度大于 0.5,高于 3000 万理论塔板数 / 米。随着计算机技术和信息科学在液相色谱技术中的广泛应用,结合人工智能技术能模拟某个领域内专家的思维过程,并且能够解决只有人类专家才能解决问题的智能计算机程序系统 。目前已有的各种色谱专家系统能推荐最佳柱系统(包括分离模式、固定相、流动相、等条件)和色谱定性等内容。色谱工作站可以很方便地进行数据处理及仪器管理等工作,如鉴定色谱峰,计算出出峰的时间、峰高及峰面积,组分含量等,对检测结果作出定性及定量结论 ;还可以对仪器的工作过程、工作条件进行自动控制,如流量、压力、温度、检测条件控制等。


液相色谱仪以独特的特点及其技术的发展,已被广泛地应用到化工、食品分析、环境分析、天然产物分析以及医药、生化、临床检验,它对于疾病的诊断和疗效监测起到了非常重要的作用。如医药方面,高效液相色谱仪可以分析药物的含量,药物在体内的残留量,测定药物在体内的代谢情况等。在生化方面高效液相色谱仪可以分离分析与生命密切相关的多种物质 , 如氨基酸、肽、蛋白质、核酸、维生素、酶、糖等。临床检验方面可以对疾病的变化通过对人体组织或体液中的异性物质进行含量改变的分析,对于疾病的诊断和疗效监测将会起到重要的作用。


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