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最新HPLC使用注意事项大全
作者:  浏览量:411  发布时间:2017-12-12 05:30:42

最新高效液相色谱仪使用注意事项大全

高效液相色谱仪(HPLC)是分析实验室常用的测试仪器之一,其被广泛应用于研究开发、医药检验、食品检测、化工分析、环境监测等众多分析领域。此种仪器在使用过程中,难免会出现各种各样的问题,并将直接影响到所测数据的准确性和仪器的正常工作。操作者如果能了解故障的成因,清楚预防和排除这些故障的方法,正确使用并维护好仪器,就能最大限度地发挥仪器的性能。今天小编特地将科捷技术大神们多年的使用经验总编成最新高效液相色谱仪使用注意事项大全,供大家参考使用。


一、流动相

首先流动相应选用色谱纯试剂、高纯水或双蒸水,酸碱液及缓冲液需经过滤后使用,过滤时注意区分水系膜和油系膜的使用范围;还有要注意水相流动相需经常更换(一般不超过2天),防止长菌变质;再就是在使用双泵时,A、B、C、D四相中,若所用流动相中有含盐流动相,则A、D(进液口位于混合器下方)放置含盐流动相,B、C(进液口位于混合器上方)放置不含盐流动相;A、B、C、D四个储液器中其中一个为棕色瓶,用于存放水相流动相。


二、试管

1、注意试管的洁净问题。

高效液相色谱分析法是一个很灵敏的分析方法,如果因使用不洁净的试管,便会影响试验结果的准确性。例如,在用甲醇作溶剂来溶解样品时,所用的小试管是用橡胶塞来做盖子的,因此,在每次进样时,都有一个保留时间固定的干扰峰存在,后经证实,此干扰峰是由甲醇浸泡橡胶塞而溶下的组分所产生,换用玻璃试管后,干扰峰消除。


2、塑料试管的溶解问题。

近年来,一次性塑料试管给试验人员带来了极大的方便,但是,在使用过程中一定要注意有机溶剂对试管的溶解现象,在利用此种试管提取样品时,有些有机溶剂(如氯仿等)对管壁有溶解现象,这些被溶解下来的物质有时也能在检测器上产生信号,从而干扰样品的测定。这时,可用相同的实验条件先行试验一下,看看不含被抽提物时,提取液在检测器上能否产生干扰信号,如确有干扰信号存在,就只能换用耐有机溶剂的玻璃试管了。


3、被测样品在试管壁上的吸附问题。

这个问题也应引起注意,否则也会影响测试结果的准确性,在治疗药物监测(Therapeutic Drug Monitoring,TDM)中,有些被测药物如阿米替林,丙咪嗪等易吸附在玻璃试管的管壁上,因此,操作中宜采用聚丙烯管,为防止提取中吸附现象的发生,可采用0.5%的已二胺已烷液做为提取剂,可有效地防止吸附。


三、样品:

1、 采用过滤或离心方法处理样品,确保样品中不含固体颗粒;

2、 用流动相或比流动相弱(若为反相柱,则极性比流动相大;若为正相柱,则极性比流动相小)的溶剂制备样品溶液,尽量用流动相制备样品液;

3、手动进样时,进样量尽量小,使用定量管定量时,进样体积应为定量管的3~5倍;


四、进样阀

目前,在分析型高效液相色谱仪中常用的进样阀是7725型进样阀,其内部的六通阀结构使进样操作非常方便,但是,如果使用不当,也会带来问题。例如,在高效液相色谱法的试验过程中,有时会有异常色谱峰的出现以及重现性不好的问题,这主要是由于操作方法不当所引起,要想解决此类问题,需从以下几个方面入手。


1、进样量的控制。用进样阀来进样时,阀内的样品环是定量的,(一般分析型进样阀的样品环体积为20ul),由于进样时,注射到进样阀内的样品溶液在样品环的管路中有径向的速度梯度(即管轴处比管壁处的液流速度快)。因此,要想使样品环中充满样品溶液,从而使用进样阀来准确地定量,则必须使进样量大于样品环体积的2倍。如果用注射器来控制进样量,则最大只能注射样品环体积1/2的量,这样才能防止部分样品由溢流管溢出从而导致定量分析的误差。


2、进样阀的清洁问题。如果样品环中有上次进样时样品的残留,必然会污染下次注射进的样品,为防止这种现象的发生,应按下列步骤操作:a.进样阀有2个位置,INJECT和LOAD。首先在LOAD位置时,以注射器将流动相注入进样阀内清洗几次,每次用量大约40ul;b.然后将进样阀板手扳至INJECT位置时,再以流动相清洗几次,每次用量还是40ul;c.最后,再将样品注射到进样阀里。


按照上述的步骤操作,可以避免由进样阀引起的污染,从而使干扰峰消除并提高分析结果的准确性。


3、进样阀溢流管的堵塞。有时,进样阀的溢流管会发生堵塞现象,向进样阀内注射样品时,注射针推不动。此故障是由于溢流管的堵塞所致。堵塞的原因多半是由于溶解样品的流动相用的是盐溶液,而其中的盐在溢流管的排空端口处结晶所致。此时,可用小烧杯盛少量蒸馏水对溢流管口稍加浸泡,端口处盐的结晶就能被溶解掉,故障排除。如能在每次进样完成之后,用蒸馏水反复冲洗至溢流管中的盐分全部冲出,则可避免此故障的发生。


五、色谱柱:

1、 使用前仔细阅读色谱柱附带的说明书,注意适用范围,如pH值范围、流动相类型等;

2、 使用符合要求的流动相;

3、 使用保护柱;

4、 如所用流动相为含盐流动相,反相色谱柱使用后,先用水或低浓度甲醇水(如5%甲醇水溶液),再用甲醇冲洗。

5、 色谱柱在不使用时,应用甲醇冲洗,取下后紧密封闭两端保存;

6、 不要高压冲洗柱子;

7、 不要在高温下长时间使用硅胶键合相色谱柱。


六、流动相(MOBLLE PHASE)的问题

甲醇和乙腈在高效液相色谱分析法中常常被用来配制流动相。高效液相色谱法中常用的试剂最好是高等级的专用试剂,如色谱纯试剂。在要求不太严格时,优级纯甚至分析纯的试剂也能用。高效液相色谱分析法中常用的是紫外检测器,因此,从降低基线噪音和提高分析灵敏度上来考虑,应该使用紫外吸收小且杂质含量少的色谱纯试剂。


1、流动相的过滤。配制好的流动相在使用前一定要先用0.5um孔径的微孔滤膜来过滤。这是因为溶液中含有很多肉眼难以发现的微小颗粒,如果不把它们滤除掉,就会堵塞泵口、柱头上的过滤器,这样就堵塞了流动相的正常通道,使色谱柱的阻力增加,柱压升高,柱效下降。碰到这种情况时,要换用经过滤的流动相,并将堵塞的滤器拆下来浸泡在20%的硝酸水溶液中以超声波清洗机清洗20分钟,以除去滤片上的堵塞物。


2、流动相的脱气。流动相在使用前必须脱气,以尽可能的除去溶解在流动相中的气体,否则,这些气体会使柱填料的性能降低,还能够对检测器的信号产生很大的干扰。脱气有多种方法,如超声脱气、真空脱气、氮气脱气等。真空脱气法和氮气流脱气法是目前最常用的脱气法。水和甲醇混合后会产生大量的气泡,如果不脱气就使用,气泡就会进入色谱柱和检测器,并将影响分析工作的正常进行。


七、图谱

长期使用后的色谱柱,如果有杂质进入,就会使色谱柱入口处的固定相“板结”并在流动相所产生的高压作用下,形成柱头的塌陷,被分析的样品组分的正常色谱峰就变成了双峰,这时可按下述方法来修复色谱柱。首先将柱头的紧固螺母旋下,这时就会发现柱头内的固定相已被压缩进去了,严重时可缩进10mm以上。在这种情况下,我们可用针尖将流动相表层板结变黄的部分抠掉,并以相同的固定相将此塌陷区填平、压实,再将色谱柱的紧固螺丝上紧,修复工作即告结束。用经过修复后的色谱柱再做样品时,色谱峰就恢复正常了。


以上是呕心沥血的最新高效液相色谱仪使用注意事项大全,从几个方面进行了详细讲解。希望大家看完能在日常工作中,对这些事项能够认真对待,做到有问题及时解决,以延长仪器的正常使用期限,发挥仪器性能的最大极限。


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