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高效液相色谱仪常见问题
作者:  浏览量:363  发布时间:2017-09-22 11:58:41

高效液相色谱仪常见问题


高效液相色谱法只要求样品能制成溶液,不受样品挥发性的限制,流动相可选择的范围宽,固定相的种类繁多,因而可以分离热不稳定和非挥发性的、离解的和非离解的以及各种分子量范围的物质。样品溶液经进样器进入流动相,被流动相载入色谱柱(固定相) 内,由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数,在两相中做相对运动时,经过反复多次的吸附- 解吸的分配过程,各组分在移动速度上产生较大的差别,被分离成单个组分依次从柱内流出,通过检测器时,样品浓度被转换成电信号传送到记录仪,数据以图谱形式打印出来。因此高效液相色谱仪应用范围非常广,应用在研究开发、医药检验、食品检测、化工分析、环境监测等众多分析领域。本文对高效液相色谱仪常见问题进行了归纳与总结,并给出了相应解决方案供大家参考,希望有所帮助!

 

问题一:反相柱与正相柱分别是什么?

答:“反相”和“正相”的概念是液相色谱法早期提出的概念,当时键合相色谱柱尚未出现,固定相被涂覆在载体表面,极易流失,为此科学家对流动相使用给出了合理的建议:流动相极性与固定液极性应具有较大差别,以减少固定液流失。固定相极性弱于流动相时的液相色谱法被称为反相色谱法,固定相极性强于流动相时的液相色谱法被称为正相色谱法。尽管目前键合相色谱柱已成为主流,但这一概念在色谱方法开发、预测出峰顺序等方面具有重要意义。

 

由上面的介绍可知具体的色谱方法、色谱柱属于正相还是反相不仅取决于固定相极性,同时还取决于流动相极性。C18(硅胶键合十八烷基硅烷)、C8(硅胶键合辛基硅烷)、PH(硅胶键合苯基硅烷)等色谱柱,由于固定相极性极低,比目前已知的任何流动相的极性都要低,因而是标准的反相柱;Silica(硅胶)、NH2(硅胶键合氨丙基硅烷)具有较高的极性,主要用于分离带有极性基团的化合物,所用流动相的极性通常低于这些固定相,因而是标准的正相柱。CN(硅胶键合腈丙基)的极性适中,当流动相极性超过CN时,它属于反相柱,反之则是正相柱。

 

问题二:什么情况下需要使用梯度洗脱梯度洗脱又是什么?

答:为了改善分析结果,某些操作需要连续改变流动相中各溶剂组分的比例以连续改变流动相的极性,使每个分析组分都有合适的容量因子k,并使样品种的所有组分可在最短时间内实现最佳分离,这种洗脱方式称为梯度洗脱。

 

梯度洗脱可在下列情形中发挥重要作用:
A 在等度下具有较宽k值的多种样品分析。
B 大分子样品分析。
C 样品含有强保留的干扰物,在目标化合物出峰后设置梯度洗脱,将干扰物洗脱出来,以免其影响下一次数据采集。
D 分析方法建立时,不知道其洗脱情况,使用梯度洗脱,找出其较优的洗脱条件。

问题三:如何降低柱子流失带来的基线漂移?

在使用新柱之前,按照以下方法老化可以使柱流失降到:用高于实验操作温度20 或者用色谱柱的操作温度(使用两者中较低者)来老化,长时间低温老化相对于短时间高温老化有利于降低色谱柱流失。

 

如果在载气当中含有少量的氧气或者水分或者气体管路漏气,在高温条件下,固定液就容易被氧化,从而造成柱流失,带来基线漂移。一旦固定液被氧化,必须使用高纯载气老化数小时,才有可能使基线趋于水平,这种对固定液的破坏是无法弥补的,所以如果有氧气连续通过色谱柱,即便进行老化基线也无法降到水平。因此,在实验过程中,应在气体管路当中使用高质量的氧气/水分过滤器,同时用高质量的电子检漏仪严格检漏。

 

问题四:封端是什么为什么要封端?

硅胶表面的硅羟基(Si-OH)密度为8 μmol/m2,由于空间位阻的存在,硅烷化键合反应最多只能覆盖50%的硅羟基,超过一半的硅羟基是活性硅羟基。这些硅羟基与化合物的极性基团存在极性相互作用和离子交换作用,为化合物的保留增加了不被期望的作用力,往往会影响峰形。用短链氯硅烷(如三甲基氯硅烷)键合活性的硅羟基,可以减小甚至消除这种影响,这种操作被称为封端(Endcap)。

 

封端处理的意义:
A.抑制了特异性吸附,提高了色谱峰的对称性,并改善了分离效果;

B.在一定程度上掩蔽了硅胶表面,使其对碱性环境的耐受性增强;
C.通过空间位阻掩盖了键合反应形成的Si-O-Si键,使其对酸性环境的耐受性增强;可能会影响对极性样品的选择性。

 

问题五:回收率重现性差

 

可能原因

改进办法

上样前,柱床干涸

重新活化并平衡

吸附剂填装松散,溶液出现短路

提出换货,或用小棍挤压柱床

样品液流速过快

降低流速,通常来说流速低于5 mL/min 时,结果是稳定的

 

问题六:净化效果不理想

A 净化模式的改进

通常而言采用保留目标化合物的模式比保留杂质的模式净化效果好,如果正在分析的项目为某一种或某一类化合物分析,是采用保留目标化合物的净化模式;举一个简单的例子,同样是分析蔬菜中的多菌灵和噻菌灵( 一类碱性农药),使用阳离子交换柱可以专一性地保留这些农药,使它们基本与干扰物完全分离,而使用正相吸附剂或石墨化碳黑进行保留干扰物的操作仅能把主要的干扰物除去,仍有较多干扰物存留。

 

另外,如果不止一种SPE 柱可用于目标化合物的净化时,应挑选选择性好的吸附剂;选择性方面,离子交换>正相>反相。

 

B 淋洗液和洗脱液的优化
对于反相模式和正相模式,应在不影响回收率的前提下,增大淋洗液洗脱的强度并降低洗脱液的洗脱强度。

 

对于反相模式,可将目标化合物的水溶液上样,然后依次用5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100% 的甲醇水溶液洗脱,分别收集洗脱液分析,建立淋洗曲线,找出目标化合物被洗脱时的溶剂体系,淋洗液中甲醇的含量应稍低于目标化合物恰好被洗脱时的溶剂体系,而洗脱液中甲醇的含量应稍高于目标化合物恰好被完全洗脱时的溶剂体系;当纯甲醇不能洗脱目标化合物时,应试验甲醇- 甲基叔丁基醚混合溶液的洗脱曲线;对于某些既不溶于水也不溶于甲醇的离子型化合物,可以在溶剂体系中加入酸或碱。

 

对于正相体系,可将目标化合物的正己烷溶液上样,然后依次用5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100% 的正己烷甲基叔丁基醚溶液洗脱,分别收集洗脱液分析,建立淋洗曲线,找出目标化合物被洗脱时的溶剂体系,淋洗液中甲基叔丁基醚的含量应稍低于目标化合物恰好被洗脱时的溶剂体系,而洗脱液中甲基叔丁基醚的含量应稍高于目标化合物恰好被完全洗脱时的溶剂体系。

 

C 对SPE 柱进行合理的处理

SPE 柱中的吸附剂可能存在少量干扰物,有效地活化可以避免这些干扰物进入洗脱液,活化溶液应选择整个操作中洗脱强度最强的溶剂体系;在反相模式中,从样品溶液到洗脱液主要涉及0%-100% 甲醇水溶液,所以活化溶液应选纯甲醇,当目标化合物需要用甲醇-甲基叔丁基醚混合液洗脱时,活化溶液应选甲基叔丁基醚;在反相模式中,从样品溶液到洗脱液主要涉及0%-100% 正己烷- 甲基叔丁基醚溶液,所以活化溶液应选纯甲基叔丁基醚。


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